Штамм вируса гриппа птиц “h5n3″ лбп-5/3 № av-0001 (казниви), используемый для изготовления вакцинных и диагностических препаратов

(51) 12 7/00 (2009.01) 61 39/00 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ вируса гриппа птиц, обеспечивающего получение диагностических препаратов с необходимой специфичностью и диагностической активностью по отношению к гомологичному вирусу и инактивированной вакцины с высокими иммуногенными свойствами. Штамм вируса гриппа птиц 53 ЛБП-5/3 семейства , (Лаборатория по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт (ТОО КазНИВИ), используемый для изготовления вакцинных и диагностических препаратов. Указанный штамм вируса птичьего гриппа депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт(72) Кутумбетов Леспек Бекболатович Кульбаева Камила Рустемовна Утепов Галымжан Абильханович Сулейменов Ринат Танатарович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт(56) Федеральное государственное учреждение Федеральный центр охраны здоровья животных(54) ШТАММ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ 53 ЛБП-5/3(КАЗНИВИ),ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано при изготовлении биопрепаратов для профилактики и диагностики вирусной болезни гриппа птиц. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении штамма 22287 Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано при изготовлении биопрепаратов для диагностики и профилактики высокопатогенного гриппа птиц. Известен штамм/// 119/97(53) вируса гриппа птиц, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Федеральное государственное учреждение Федеральный центр охраны здоровья животных (ФГУ ВНИИЗЖ) . Недостатком известного штамма вируса является то, что он обладает способностью репродуцироваться только в развивающихся куриных эмбрионах и вследствие чего технология получения его биомассы трудоемкая. Задачей изобретения является получение штамма вируса гриппа птиц 53, пригодного для культивирования в культурах клеток высокопроизводительным способом, который позволит получать биомассу вируса с высоким титром инфекционных вирусных частиц. Технический результат, обеспечиваемый изобретением, выражается в получении штамма вируса высокопатогенного гриппа птиц, способного репродуцироваться в культуре клеток фибробластов куриных эмбрионов (ФКЭ), пригодных для приготовления диагностических и вакцинных препаратов с достаточными диагностическими и иммуногенными активностями. Штамм вируса гриппа птиц ЛБП-5/30001 (КазНИВИ), используемый для накопления биомассы возбудителя, необходимой в изготовлении диагностических и вакцинных препаратов,получают путем репродукции его в культуре фибробластов развивающихся куриных эмбрионов(РКЭ), свободных от патогенной микрофлоры. Указанный штамм вируса птичьего гриппа депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт(ТОО КазНИВИ). Штамм вируса гриппа птиц 53 ЛБП-5/3-0001 (КазНИВИ). Штамм получен из эпизоотического вируса гриппа птиц, доставленного из ФГУ ВНИИЗЖ,Российская Федерация. Полученный штамм характеризуется следующими признаками. Назначение штамма штамм ЛБП-5/30001 (КазНИВИ) вируса гриппа птиц патогенен по отношению к цыплятам, перепелятам и обладает высокой репродуктивностью в РКЭ, ФКЭ которые способствуют накоплению вирионов вируса в повышенных концентрациях в единице объема экстраэмбриональной жидкости. Высокие концентрации вируса в биоматериале обуславливают возможность получения из них вакцинного препарата с высокими иммунобиологическими параметрами и диагностикумов с активными диагностическими компонентами. Морфологические признаки. Вирус гриппа птиц, роду , имеет липопротеидную оболочку, размер вирионов вируса в пределах от 80 до 120 нм. Штамм ЛБП-5/3-0001 (КазНИВИ) вируса обладает морфологическими признаками,свойственными для возбудителя вируса гриппа птиц рода , семейства . Культуральные свойства. Штамм ЛБП-5/3-0001 (КазНИВИ) вируса гриппа птиц обладает высокой репродуктивностью в РКЭ, и ФКЭ накапливаясь в них до 1070- 10775 УЕ 50/см 3. Антигенные свойства. Штамм ЛБП-5/30001 (КазНИВИ) вируса гриппа птиц в организме кур, перепелов, кроликов и коз стимулирует образование антигемагглютининов (5-7 2 и выше) и вируснейтрализующих антител (5 2 и выше). Патогенные свойства. Штамм ЛБП-5/30001 (КазНИВИ) вируса гриппа птиц патогенный по отношению к курам. Среди зараженных цыплят 2530-суточного возраста не иммунных к гриппу,данный штамм вируса вызывает 100 заболеваемость, которая заканчивается летальным исходом и вызывает гибель всех заболевших птиц, с таким же показателем процента в течение 3-7 суток. Иммуногенные свойства. Штамм ЛБП-5/3-0001 (КазНИВИ) вируса гриппа птиц,репродуцированный в организме птицы, вызывает заболевание с высоким процентом гибели. А в РКЭ в дозе от 1,0 ЭИД 50 вызывает заболевание без случаев выздоровления. Поэтому установление иммуногенности живого вируса на использованных цыплятах не представляет возможности. Для этой цели используют инактивированный вирус, который при внутримышечном введении стимулирует формирования в организме привитой птицы факторов иммунитета (антигемагглютининов и вируснейтрализующих антител), которые защищают от контрольного заражения вирулентным вирусом. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма ЛБП 5/3-0001 (КазНИВИ) вируса гриппа птиц,при культивировании в РКЭ и ФКЭ, свободных от патогенной микрофлоры, сохраняются в течение не менее 10 последовательных пассажей (срок наблюдения). Сохраняемость. Штамм ЛБП-5/3-0001(КазНИВИ) вируса гриппа птиц в экстраэмбриональной и культуральной жидкостях сохраняет свою исходную биологическую активность при температуре 41 С в течение 40 суток (срок наблюдения), при минус 18-20 С-3 месяцев, а при минус 40 С-12 месяцев. Лиофилизированный вирус в смеси со стабилизирующей средой, содержащей пептон 4, сахарозу 5 и желатин 0,5-1,0,сохраняет биологическую активность при температуре 41 С в течение не менее 12 месяцев,при минус 40 С-3 года. Пример 1. Для приготовления диагностического антигена штамм ЛБП-5/3-0001 (КазНИВИ) вируса гриппа птиц репродуцируют в 10-суточных РКЭ или ФКЭ свободных от патогенной микрофлоры. В аллантоисную полость эмбрионов или на монослой клетки ФКЭ асептический вносят 22287 заражающую вирусную суспензию в объеме,содержащем вирус в дозе 103-104 ЭИД 50 (ТЦД 50) и продолжают инкубировать их при температуре 3738 С. Через 48-72 ч после введения вируса эмбрионы охлаждают при температуре 4-8 С в течение 4-18 ч, асептически вскрывают и собирают хориалонтоисную жидкость,которую затем подвергают фильтрации через 4-х слойную марлевую салфетку и испытанию на стерильность по ГОСТ 28085 и гемагглютинирующую активность титрованием в реакции геагглютинации с эритроцитами петуха. Культуру клетки ФКЭ замораживают в момент развития ЦПД в 80 и более в площади монослоя, размораживают и используют как биомассу вируса. Очищенную,стерильную и имеющий гемагглютинирующий титр не ниже 7 2 биомассу вируса обрабатывают формальдегидом в концентрации 0,05 при температуре 370,5 С в течение 36 ч. Остатки формальдегида нейтрализуют сульфитом натрия и биомассу подвергают испытанию на стерильность по ГОСТ 28085 и на полноту инактивации вирионов заражением 10 суточных РКЭ и ФКЭ в трех последовательных пассажах. В случае отсутствия посторонних контаминантов и вирионов вируса гриппа,способных к репродукции, смешивают с сахарозапептонно-желатиновой средой в соотношении 11 по объему и полученную массу в объеме по 1,0 см 3 подвергают сублимационной сушке в ампулах или флаконах. Высушенную форму вируса используют в качестве диагностического антигена после растворения физиологическим раствором и разведения до гемагглютинирующей активности 4 ГАЕ для выявления специфических антител в реакции торможения гемагглютинации. Пример 2. Для приготовления инактивированной вакцины штамм ЛБП-5/3-0001 (КазНИВИ) вируса гриппа птиц репродуцируют в монослойной культуре фибробластов свободных от патогенной микрофлоры эмбрионов кур,выращенных стационарным способом в среде ИГЛА-МЕМ,содержащей 10 сыворотки крови крупного рогатого скота. Для инфицирования используют клетки со сплошным рыхловатым монослоем без каких либо дегенеративных изменений, полученным в течение 24-30 ч культивирования после первичной трипсинизации и высева фибробластов в сосуды. В культуральную жидкость монослойной культуры клеток в сосудах вносят заражающую вирусную суспензию в объеме, содержащем вирус в дозе 0,10,01 ТЦД 50/Кл и продолжают инкубировать культуру клеток в сосудах в течение до появления цитопатогенного действия, обычно этот срок составляет 18-24 ч. Из сосудов с зараженной культурой клеток удаляют ростовую питательную среду и вносят поддерживающую, содержащую в составе среду ИГЛА-МЕМ и 5 сыворотки крови крупного рогатого скота. Культуру клеток с вирусом после замены питательной среды инкубируют при той же температуре еще в течение 24-48 ч, до развития цитопатогенного действия вируса в не менее чем 80 площади монослоя клеток. В период максимального развития цитопатогенного действия вируса культуру клеток в сосудах подвергают замораживанию при температуре минус 40 С в течение менее чем 3 ч. Затем содержимое сосудов размораживают при комнатной температуре или при температуре 37 С при периодическом механическом встряхивании. Содержимое нескольких аналогичных сосудов объединяют и полученную культуральную суспензию подвергают испытанию на стерильность и биологическую активность. При отсутствии посторонних контаминантов микробиологического, микологического характера и наличии титра вируса в суспензии не ниже 1075 ТЦД 50/см 3 биомассу вируса фильтруют через 4-х слойную стерильную марлевую салфетку,добавляют инактивант (формальдегид) в конечной концентрации 0,05 и выдерживают при температуре 370,5 С в течение 36 ч. Остатки формальдегида нейтрализуют сульфитом натрия и подвергают испытанию на стерильность по ГОСТ 28085 и на полноту инактивации вирионов заражением 10-суточных РКЭ или ФКЭ в трех последовательных пассажах. В случае отсутствия посторонних контаминантов и вирионов, способных к репродукции, культуральную биомассу с инактивированным вирусом смешивают с адъювантом Монтанид ИЗА-70 в соотношении 37 и подвергают эмульгированию. Полученную таким образом белую с розовато красным оттенком стойкую однородную эмульсию используют в качестве инактивированной вакцины для иммунизации. Птицу иммунизируют внутримышечной инъекцией вакцины в дозе 0,25-0,5 см 3. Для проверки иммуногенности испытуемого препарата привитую птицу в количестве 10 гол подвергают контрольному заражению вирулентным вирусом в дозе по 104 ЛД 50/гол на 14 сутки после вакцинации. Таким же образом заражают вирусом 10 контрольных(не вакцинированных) цыплят аналогичного возраста. За поголовьем опытной и контрольной групп птицы наблюдают в течение 14 суток. За указанный период не менее чем 8 гол вакцинированной птицы остаются здоровыми и живыми, тогда как не менее чем 8 гол контрольной птицы заболевают и погибают от болезни гриппа. Пример 3. Для приготовления специфической сыворотки штамм ЛБП-5/3-0001(КазНИВИ) вируса гриппа птиц репродуцируют в 10-суточных РКЭ или в культуре ФКЭ свободных от патогенной микрофлоры. В аллантоисную полость эмбрионов или на монослой клетки ФКЭ асептический вносят заражающую вирусную суспензию в объеме, содержащем вирус в дозе 103104 ЭИД 50 и продолжают инкубировать их при температуре 37-38 С. Через 48-72 ч после введения вируса эмбрионы охлаждают при температуре 4-8 С клетки замораживают в течение 4-18 ч, асептически вскрывают и собирают хориалонтоисную и культуральную жидкости, которое затем подвергают фильтрации через 4-х слойную марлевую салфетку и испытанию на стерильность по ГОСТ 28085,биологическую и гемагглютинирующую активности 3 22287 титрованием в РКЭ и в реакции геагглютинации с эритроцитами петуха. Очищенную, стерильную и имеющий гемагглютинирующий титр не ниже 7 2, а также инфекционный титр 107,5 ЭИД 50 (ТЦД 50) и выше биомассу вируса инактивируют формальдигитом и в дозе по 1,0 см 3 вводят внутримышечно перепелам. Через 14 и 30 суток иммунизацию повторяют, а на 37-40 сутки собирают кровь у гипериммунизированной птицы после декапитизации. Из крови получают сыворотку,которую исследуют на содержание антигемагглютининов. Полученную сыворотку сублимируют без стабилизаторов в дозе по 0,5 см 3 в ампулах или флаконах. Сухую сыворотку используют в качестве специфической для идентификации возбудителя болезни в реакции торможения гемагглютинации. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм вируса гриппа птиц 53 ЛБП-5/3 (-0001 (КазНИВИ), Лаборатория по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт),используемый для изготовления вакцинных и диагностических препаратов.