Рекомбинантный штамм A/AstanaRG/6:2/2009 М-12-09/D вируса гриппа, предназначенный для производства диагностических и вакцинных препаратов против гриппа A/H5N1

(51) 61 39/145 (2010.01) 12 7/00 (2010.01) 12 1/93 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН/51,наиболее близкий к репрезентативным штаммам клайда 2.2,рекомендованных ВОЗ для производства противогриппозных вакцин. Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии, и представляет собой новый актуальный рекомбинантный штамм вируса гриппа (ВГ),прошедший 1 пассаж в клеточной культуреи 2 пассажа на 10-11-сут- куриных эмбрионах. Инфекционная и гемагглютинирующая активность вируса на 10-11-сут РКЭ составляет 7,75 ЭИД 50/см 3 и 8,0 2, соответственно. Активность штамма в серологических реакциях составляет 1214 в РДП, 160-180 в РТГА и 11280 в ИФА. Рекомбинантный штамм //62/2009 ВГ апатогенен для РКЭ, цыплят и белых мышей. Вирус имеет трипсинозависимый фенотип в культуре клеток , характерный для низкопатогенных вирусов гриппа. Филогенетический анализ гемагглютинина и нейраминидазы штамма- донора ///6/05 (51) показал его принадлежность к клайду 2.2, представители которого рекомендованы ВОЗ при отборе кандидатов для разработки вакцины против гриппа. Результаты секвенирования подтвердили, что последовательность гена гемагглютинина (НА) рекомбинантного штамма / /62/2009 содержит модифицированный сайт расщепления НА и сохраняет мутацию,введенную для предотвращения возврата к дикому типу.(72) Мамадалиев Сейдигапбар МамадалиевичКисилев Олег ИвановичСандыбаев Нурлан ТамамбаевичХайруллин Берик Мухитович Цыбалова Людмила МарковнаГрудинин Михаил ПавловичМамбеталиев Муратбай Кыдырбаев Жайлаубай КыдырбаевичТабынов Кайсар КазыбаевичСтрочков Виталий МихайловичТабынов Кайрат Казыбаевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан//62/2009 М-12-09/ ВИРУСА ГРИППА,ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ГРИППА /51(57) Сконструированрекомбинантный штамм //62/2009 -12-09/ вируса гриппа,предназначенный для производства диагностических и вакцинных препаратов против новый актуальный рекомбинантный штамм вируса гриппа,используемый для производства диагностических и вакцинных препаратов против гриппа А/Н 51. Известен рекомбинантный штамм вируса гриппа- (,05/160) полученный методом обратной генетики из штаммов /(Н 11) используемый для производства вакцины против гриппа /51 ( . ,. ..2007 15-9 Недостатком этого рекомбинантного штамма является входящий в его состав высокопатогенный штамм - донор //1194/2004 (51),который относится к 1 клайду вируса гриппа/51 по классификации ВОЗ являющиеся далеким от рекомендованных новых вакцинных штаммов кандидатов//244/05 полученных методом обратной генетики. Наиболее близким к заявляемому техническому решению (прототипом) является рекомбинантный штамм вируса гриппа А/курица/Курган/5/05181/62 (51),,, . .512005 //. . . 42 (1), 7078 (2008), полученный методом обратной генетики из штаммов А/курица /Курган /5/05 (51) и 116 (реассортант вирусов / /8/34 и/ /20/99), который относится к клайду 2.2 вируса гриппа /51 и по классификации ВОЗ близок к рекомендованным новым вакцинным кандидатам //2005- , / //244/05 полученных методом обратной генетики//.). По сравнению с прототипом предлагаемый рекомбинантный штамм//62/2009 вируса гриппа отличается тем, что в его составе имеется высокорепродуктивный штамм-донор //8/34 (11), тогда как в прототипе использован штамм-донор 116 (реассортант вирусов/20/99). Задачей настоящего изобретения являлось конструированиенового актуального рекомбинантного штамма вируса гриппа, наиболее близ кого к репрезентативным штаммам клайда 2.2,рекомендованных ВОЗ для производства диагностических и вакцинных препаратов против вируса гриппа /51, обладающего низкой вирулентностью и высокой репродуктивной активностью в системе культивирования. Предлагаемое изобретение включает рекомбинантный штамм,совокупность 2 существенных признаков которого, обеспечивает получение следующих технических результатов. Рекомбинантный штамм / /62/2009 вируса гриппа, получен методом обратной генетики из высокопатогенного штамма-донора ///6/05 (51) и высокорепродуктивного штамма-донора //8/34 (11). Штамм-донор // /6/05 (51) был выделен в Акмолинской области Республики Казахстан в 2005 году и является высокопатогенным штаммом с антигенной формулой 51. Филогенетический анализ гемагт-лютинина показал его принадлежность к клайду 2.2, представители которого рекомендованы ВОЗ при отборе кандидатов для разработки препандемических вакцин против гриппа /51 (Приложение А). В связи с этим высокопатогенный штамм/ / /6/05 (51) был выбран в качестве донора поверхностных белков гемагглютинина(модификация сайта протеолитического расщепления) и нейраминидазы. Штамм-донор//8/34 (11) вируса гриппа рекомендован ВОЗ для конструирования рекомбинантных штаммов гриппа методом обратной генетики,так как отличается высокими репродуктивными свойствами в системе культивирования (куриные эмбрионы). В связи с этим выбран в качестве донора внутренних белков РВ 2, РВ 1, , , М и . Для конструирования рекомбинантного штамма//62/2009 вируса гриппа использованы 8 плазмид, каждая из которых содержала один из шести внутренних генов (РВ 2, РВ 1,, , и ), полученных от штамма-донора //8/34 ( 11) двух поверхностных белков (НА и ),полученных от штамма-донора /// /62/2009 вируса гриппа состоит их следующих этапов (Приложение Б) 1. Амплификация полноразмерных сегментов НА иштамма / //6/05(51). Для получения полноразмерных сегментов гемагглютинина и нейраминидазы были подобраны праймеры,позволяющие амплифицировать последовательности сегментов. Первоначально проводили наработку к ДНК вируса гриппа с помощью универсального праймера-12. Состав реакционной смеси для наработки полных сегментов НА ибыл следующий Вода- 2 мкл Общий объем реакционной смеси составлял 50 мкл. Температурно-временной режим амплификации 94 С - 4 мин 94 С - 20 сек 56 С - 30 сек 30 циклов 72 С - 4 мин 72 С - 7 мин Анализ продуктов амплификации проводили в 1 агарозном геле на буфере ТВЕ. Так как штамм ///6/05(51) является высокопатогенными имеет сайт протеолитического расщепления гемагглютинина с мотивом повторяющихся аминокислот, то необходимо было внести мутацию в этот участок путем удаления этого мотива . Кроме того,для предотвращения возможности восстановления мотива повторяющихся основных аминокислот за счет соскальзывания полимеразы, были введены замены Т и КТ (Приложение В) В результате, мотив повторяющихся основных аминокислот высокопатогенного штамма ///6/05(51) был заменен на последовательность /, которая характерна для низкопатогенных штаммов Н 5 вируса гриппа. 2. Клонирование НА, , РВ 1, РВ 2, , , М ив плазмиду 2000 Полноразмерные последовательности сегментов НА,от штамма / / /6/05(51) и сегменты от штамма / /8/34 (11) РВ 1, 2, , , ,были клонированы в двунаправленную экспрессионную плазмиду 2000. Для клонирования использовали ПЦР продукты наработанные с помощью праймеров,имеющих на своем 5-конце сайт для расщепления рестриктазой . Для клонирования плазмиду 2000 и ПЦР - продукты разрезали данной рестриктазой с целью получения липких концов. Лигирование проводили с использованием набора, ,инструкции изготовителя. 3. Наработка плазмид. Смесью лигированных плазмид трансформировали компетентные клетки-с использованием методики- ,который проводили при 42 С в течение 45 сек. Полученную смесь трансформированных клеток высевали на чашки Петри со средой ВагаромампициллинРТха. Инкубировали в течение ночи при температуре 36 С. Отбор трансформантов проводили по методу бело-синих колоний. Отбирали отдельные колонии и пересевали на жидкую среду с ампициллином. Трансформированные бактерии выращивали в течение ночи в не большом объеме жидкой питательной среды. Во всех случаях бактериальная ростовая среда состояла из питательного бульонас ампициллином. Плазмидную ДНК выделяли с использованием набора. 4. Трансфекция клеток 2000 является двунаправленной экспрессионной плазмидой и не требует дополнительных экспрессионных плазмид. Для получения рекомбинантного штамма//6.-2/2009 вируса гриппа наработанные плазмиды/ 12 с добавлением 10 фетальной бычьей сыворотки и 2- ) с использованием 2000. Для трансфекции готовили смесь плазмид,которая содержит по 1 мкг каждой плазмиды со вставками (всего 8 плазмид) и добавляем среду-МЕМ до конечного объема 50 мкл для каждой ДНК трансфекции. Далее готовили мастер-микс смесь 2000. Для этого в конической 50 мл пробирке смешиваем 250 мкл среды - с 12 мкл 2000, осторожно перемешиваем пипетированием и инкубируем при комнатной температуре в течение 10 мин. К каждому образцу ДНК для трансфекции добавляли по 262 мкл смеси 2000 со средой- ,перемешивали пипетированием и оставляли при комнатной температуре на 30 мин. Трансфецированные клетки сеяли в 6-луночные планшеты. В каждую ячейку планшета добавляли по 1,25 мл ресусиендированной культуры клетоки вносили смесь ДНК с 2000(около 320 мкл). Планшеты инкубировали в течение 8-12 часов при температуре 37 С. Через 16 часов осторожно убирали среду из каждой лунки планшета и к каждой лунке добавляли по 1,5 мл средыи по 1,5 мкл трипсина (1 мг/мл). Через 2 дня после развития цитопатического эффекта собирали супернатант и использовали его для проведения теста бляшкообразования и для заражения куриных эмбрионов. В тесте бляшкообразования рекомбинантный штамм / /62/2009 вируса гриппа продуцировал бляшки на клеткахтолько в присутствии трипсина. Результаты данного теста подтвердили наличие трипсинозависимого фенотипа, характерного для низкопатогенных ви русов гриппа. 5. Наработка рекомбинантного штамма в развивающихся куриных эмбрионах. Культуральным вариантом полученного рекомбинантного штамма //62/2009 вируса гриппа заражали куриные эмбрионы при температуре инкубирования(330,5)С. Восстановленный двумя пассажами на развивающихся куриных-эмбрионах вирус обозначен как рекомбинантный штамм //62/2009 вируса гриппа. 6.Секвенирование генов рекомбинантного штамма / /62/2009. С целью определения соответствия нуклеотидного состава сегментов ре комбинантного штамма к исходному, было проведено секвенирование генов НА ирекомбинантного штамма //62/2009 вируса гриппа. В результате секвенирования и анализа нуклеотидных последовательностей было показано,3 полностью соответствует последовательности дикого типа штамма / //6/05(51). Сегмент НА имеет последовательность,совпадающую с последовательностью модифицированного сегмента. Для подтверждения стабильности модифицированной последовательности гена НА было проведено 5 дополнительных пассажей рекомбинантного штамма / /62/2009 вируса гриппа на куриных эмбрионах. Секвенирование последовательности гена,кодирующего НА подтвердили наличие модификации в сайте расщепления гена гемагглютинина (Приложение Г). Проведенные исследования показали,что рекомбинантный штамм / /62/2009 вируса гриппа в процессе пассирования (5 пассажей) на куриных эмбрионах проявляет стабильные свойства. Как видно из данных, представленных в приложении Г,нуклеотидные последовательности модифицированного участка гена гемагглютинина, как у исходного рекомбинантного штамма, так и у штамма, прошедшего различные пассажи полностью идентичны. В приложении Г также показано наличие последовательности основных аминокислот в сайте разрезания гемагглютинина у дикого штамма ///6/05(51),в то же время отсутствующего у рекомбинантного штамма. 7. Паспортизация рекомбинантного штамма/ /62/2009 вируса гриппа. 7.1 Проверка безвредности рекомбинантного штамма / /62/2009. Безвредность полученного рекомбинантного штамма //62/2009 вируса гриппа было подтверждено в следующих лабораторных тестах интравенозный индекс патогенности на цыплятах, в тесте патогенности для белых лабораторных мышей и куриных эмбрионов. Интравенозный индекс патогенности вируса/ /62/2009 на 42-суточных цыплятах составил 0,00. Штамм отнесен к низкопатогенному варианту вируса гриппа, так как его ИВИП составляет 1,2. В тесте патогенности на 2-3 недельных белых мышах было установлено, что рекомбинантный штамм //62/2009 вируса гриппа апатогенен для белых мышей по сравнению с исходным диким штаммом // /06/05(51). В тесте патогенности на куриных эмбрионах было показано, что рекомбинантный штамм //62/2009 вируса гриппа способен расти до высоких титров, не вызывая гибели куриных эмбрионов. 7.2 Антигенный анализ рекомбинантного штамма. Антигенное анализ рекомбинантного штамма //62/2009 со штаммом-донором ///6/05 (51) подтверждено в РТГА. В результате постановки РТГА установлено, что рекомбинантный штамм //62/2009 соответствует по антигенной структуре дикого штамма // /6/05 (51). 7.3 Определение биологической активности рекомбинантного штамма Биологическая активность наработанного рекомбинантного штамма //62/2009 после лиофилизации с 6,5 пептоном в конечной концентрации составила 7,75 1 ЭИД 50 см 3 с гемагглютинирующей активностью 1256. 7.4 Стерильность рекомбинантного штамма. Тесты на бактериальную и грибковую контаминацию показали стерильность рекомбинантного штамма / /62/2009 вируса гриппа в отношении бактериальных и грибковых микроорганизмов. В результате проведенного скрининга посевного штамма //62/2009, наличие плазмидной ДНК не обнаружена. 7.5 Стабильность сохранения основных биологических свойств рекомбинантного штамма Проверяли стабильность сохранения основных биологических свойств 3-х серий рекомбинантного штамма / /62/2009 вируса гриппа при долгосрочном хранении. С этой целью ежемесячно в течение 6 месяцев проверяли биологическую активность и гемагглютинирующий титр вируса,хранящего при температуре минус 20 С. Установлено,что все серии рекомбинантного штамма //62/2009 вируса гриппа сохраняют свою исходную биологическую и гемагглютинирующую активность. Полученный рекомбинантный штамм //62/2009 вируса гриппа депонирован в Коллекции микроорганизмов Дочернего государственного предприятия Научно-исследовательского института проблем биологической безопасности Республиканского государственного предприятия Национального центра биотехнологии Республики Казахстан Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан (ДГП НИИПББ НЦБ РК КН МОН РК) с регистрационным номером М-1209/ и хранится в лиофилизированном виде с защитной средой - 6,5 пептон в соотношении 11(рН 7,2-7,6), при минус 40-70 С в ампулах ШПБ-6 под вакуумом. Жизнеспособность рекомбинантного штамма в стабильном состоянии поддерживается путем ежегодного освежения на 10-11-суточных развивающихся куриных эмбрионах. Активность рекомбинантного штамма //62/2009 вируса гриппа в серологических реакциях составляет 12-14 в РДП, 160-180 в РТГА, 11280 в ИФА. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Рекомбинантный штамм //62/2009 вируса гриппа, депонированный в Коллекции микроорганизмов ДГП НИИПББ РГП НЦБ РК КН МОН РК, предназначенный для производства диагностических и вакцинных препаратов против гриппа 51.