Способ получения антицеллюлярного иммуноглобулина для превентивного лечения бешенства животных

(51) 61 39/205 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ иммуноглобулина для превентивного лечения бешенства животных. Техническим результатом является получение эффективного препарата для превентивного лечения животных. Способ получения антицеллюлярного иммуноглобулина включает в себя следующие технические операции получение взвеси ткани головного и спинного мозга /овец, собак/, получение антицелюлярной сыворотки,выделение из полученной сыворотки иммуноглобулинов,растворение иммуноглобулинов в 0,9 растворе хлорида натрия, содержащего 1,8 гипосульфита натрия с последующим лиофильным высушиванием.(72) Рожаев Балтабек Галиевич Муралинов Каримхан Каирханович(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИЦЕЛЛЮЛЯРНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА ДЛЯ ПРЕВЕНТИВНОГО ЛЕЧЕНИЯ БЕШЕНСТВА ЖИВОТНЫХ Изобретение относится к иммунологии, в частности к способу получения антицеллюлярного иммуноглобулина для превентивного лечения бешенства животных. Способ получения антицеллюлярного иммуноглобулина для превентивного лечения бешенства животных включает гипериммунизацию животных - доноров антигенами из головного и спинного мозга, в которых происходит тропизм вируса бешенства. Получение специфической антицелюлярной сыворотки содержащая идиотипы в реакций диффузной преципитаций титрах от 1 32 и выше,выделение методом осаждения иммуноглобулинов этанолом и стабилизирование гипосульфитом натрия. Известен способ получения гамма-глобулинов из нормальной сыворотки крови с помощью фракционирования сывороточных белков этанолом(Хохлачв Н.В. и др. Препараты из крови человека. Гамма-глобулин. //Руководство по вакцинному и сывороточному делу. М., 1979, с. 322-328). Однако полученные из нормальной сыворотки иммуноглобулины не обладают специфическими свойствами и поэтому не могут применяться для иммунокоррекции инфекционного гепатита у плотоядных животных. Наиболее близким к изобретению является способ получения поливалентной сыворотки против чумы, парвовирусного энтерита, аденовирозного гепатита и лептоспироза плотоядных включающую иммунизацию ослов путем введения трех вирусных и одного бактериального антигена (19)(13) А(11) 14176 (51)7 А 61 39/295, А 61 35/16. Препарат, полученный известным способом,предназначен для лечения чумы, парвовирусного энтерита, аденовирозного гепатита и лептоспироза плотоядных животных. Недостатком данного способа является то, что применение данного препарата вызовет иммунные расстройства у леченных им животных. В настоящее время лечение инфекции вирусной этиологии, являются проблематичным. Связано это с тем, что применяемые для лечения специфические сыворотки вызывают поражение иммунной системы и нарушение механизма неспецифической защиты. Решением ВОЗ в медицинской практике запрещено применение специфических гипериммунных сывороток для лечения инфекционных болезней т.к. это вызывает образование иммунных комплексов, и развитие болезни иммунных комплексов это положение касается и ветеринарной практики. Задачей изобретения является разработка способа получения иммуноглобулина для превентивного лечения бешенства животных,которое не вызывало иммунных расстройств и образование иммунных комплексов т.к. является неспецифическим по отношению к вирусу бешенства. Техническим результатом является способ получения антицеллюлярного иммуноглобулина для превентивного лечения бешенства животных, путем гипериммунизацию животных - доноров тканями из головного и спинного мозга, в которых происходит 2 тропизм и размножение вируса бешенства. Получение специфической антицелюлярной сыворотки содержащую идиотипы в реакции диффузной преципитации в титрах от 1 32 и выше,а также выделение методом осаждения иммуноглобулинов этанолом и стабилизирование гипосульфитом натрия. Технический результат достигается следующим методом Животных доноров (ослов, лошадей или кроликов) иммунизируют трижды взвесью ткани из головного и спинного мозга овцы или собаки в адъюванте Фрейнда или гидроокиси алюминия(ГОА) подкожно из расчета 0,25 мл/кг живой массы,интервалом 7 дней. Взятие крови проводят на 21 день после последней иммунизации,полученную гипериммунную сыворотку - идиотип против ткани головного и спинного мозга проверяют на активность в реакции диффузной преципитации,которая должна быть в пределах от 132 и выше. Из полученного идиотипа против мозговой ткани выделяют иммуноглобулины методом фракционирования этанолом Осажденный иммуноглобулин растворяют в изотоническом растворе хлорида натрия содержащего 1,8 гипосульфита натрия(стабилизатор и сорбент). Препарат разливают в ампулы по 2 или 5 мл и подвергают лиофильной сушке. Перед употреблением содержимое ампулы растворяют в 2 мл дистиллированной воды или изотонического раствора хлорида натрия. При хранении препарата в температурном режиме 4 С в течение 2-х лет препарат сохраняет первоначальную активность. Препарат вводится подкожно двукратно или трехкратно с интервалом 5-7 дней. При показаниях повторное применение по этой же схеме спустя 3-4 недели. Применение препарата полученного данным способом обуславливает превентивное лечение бешенства животных зараженных бешенством. Применение с профилактической целью показало его хорошее превентивное действие, на месте инъекции возможно возникновение небольшого покраснения с незначительным отеком, которое проходит в течение 1-2-х дней без последствия. Пример В качестве антигена использовали ткани головного и спинного мозга овцы или собаки,которые измельчают ножницами, затем тщательно отмывают сначала дистиллированной водой, затем физиологическим раствором до полного исчезновения видимых примесей крови,гомогенизируют с прибавлением физиологического раствора из расчета 9 мг на 1 г ткани. Полученную суспензию используют в качестве антигена. Антиген подвергают обработке антибиотиками (по 10 тыс. ЕД кефзола на 1 мл материала), выдерживают 2 часа в термостате при температуре 37 С. Соотношение антигена и адъюванта берут 12. Антиген вводят подкожно, из расчта 0,25 мл/кг живой массы с интервалом 7 дней, трхкратно. В качестве животных-доноров используют ослов или лошадей. Взятие крови проводят на 21 день после последней иммунизации в объме 2-3 литров. Полученную сыворотку консервируют 0,5 раствором фенола и проверяют на активность,стерильность и токсичность. На бактериальную стерильность сыворотку проверяют посевом на МПБ и питательный агар. Токсичность полученных препаратов проверяют путм подкожного введения кроликам в объме по 0,5 мл, с использованием по 3 кролика на каждую серию, а также шести белых мышей, которым вводят внутрибрюшинно по 0,3 мл, с последующим наблюдением за всеми животными в течение 10 дней. Из полученной антицелюлярной сыворотки выделяли методом фракционирования этанолом,иммуноглобулины растворяли их в изотоническом растворе хлорида натрия, содержащим 1,8 гипосульфита натрия. Препарат разливали в ампулы по 2 или 5 мл и подвергали лиофильной сушке. Перед употреблением содержимое ампулы растворяли в 2 мл дистиллированной воды. Изучение ингибирующего действия проводили с использованием фикс вируса бешенства, штамм овечьи (200 ЦПД 50) В культуру клеток вводили испытуемые разведения испытуемой и контрольной сывороток, после чего к ним водили вирус бешенства в разведении 110. Наблюдение велось в течение 10 суток. В начале эксперимента изучалось ингибирующее специфическое воздействие антицелюлярного иммуноглобулина на репродукцию вирусов в на куриных эмбрионах. Для контроля были взяты применяемые в ветеринарной практике сыворотки для лечения инфекционного гепатита и нормальные иммуноглобулины. При введение антицелюлярного иммуноглобулина через 24 часа после заражения эмбриона в хориоаллантоисную оболочку вирусом,титры гемагглютининов были в 8 - 10 раз выше, чем при применение лечебной сыворотки, что свидетельствовало о его более выраженном вирусингибирующим действии. Введение нормальной сыворотки не вызывало образование гемагглютининов. Высокая активность специфического иммуноглобулина против бешенства связана с тем, что препарат обладает способностью блокировать клеточные рецепторы,подавляя размножение вирусов. Для изучения лечебной эффективности и возможности применения антицеллюлярного иммуноглобулина с практической целью было исследовано его ингибирующее действие на репродукцию вирусов в культурах клеток почки хомяка. При постановке основных опытов устанавливалась степень вирусингибирующего воздействия методом титрации вышеназванных биопрепаратов в разведениях от 110 до 1640. Возможные неспецифические ингибиторы в испытуемых биопрепаратах устраняли подогреванием их в водяной бане в течение 30 минут при 56 С. Для контроля аналогичные опыты были поставлены с нормальными сыворотками и культуры клеток без внесения биопрепаратов. Наблюдение проводилось в течение 10 суток. Установлено,что антицеллюлярный иммуноглобулин на 2-4 сутки обуславливает цитопатический эффект в разведение 164, на 5-6 сутки в разведении 1128, на 8 сутки ЦПД 50 составил 1256 и на 10-е сутки был в пределах до 1 1024. Применяемая для лечения инфекционного гепатита сыворотка обладала вирусингибирующим эффектом в разведении 1128 в течение 3 суток, в разведении 164 до 5 суток. В разведении 1256 и выше вирусингибирующим действием не обладала. Нормальные сыворотки, полученные от лошадей,коров, овец и кроликов вирусингибирующим действием не обладали. Антицеллюлярный иммуноглобулин применялся для иммунокоррекции инфекционного гепатита у собак населения г. Алматы в клинике национального аграрного университета. Всего антицеллюлярный иммуноглобулин был применен с положительным лечебным эффектом на 186 собаках. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антицеллюлярного иммуноглобулина для превентивного лечения бешенства животных, включающий подкожную гипериммунизацию животных-продуцентов взвесью с адъювантом Фрейнда, с последующим получением от них сыворотки крови,выделением иммуноглобулинов путем фракционирования этанолом, стабилизированных хлоридом натрия и гипосульфитом натрия, отличающийся тем, что в качестве взвеси используют ткани головного и спинного мозга овцы или собаки.