Способ получения моноспецифических антител к гемагглютинину Н5 вируса гриппа А

(51) 61 39/395 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ последующим разделением осажденного вируса от надосадочной жидкости центрифугированием при 5000(4 С),ультрацентрифугирование при 106000 в течение 120 мил и 5000 в течение 10 мин (4 С),ресуспендирование очищенного вируса в 100 кратном, от первоначального, объме стерильного 0,05 М раствора ФСБ (рН 7,2-7,4), определение гемагглютинирующей активности и концентрации белка в препарате, затем разрушение очищенного вируса с помощью твин-эфира в соотношении - 11 с последующим удалением неразрушенных вирионов ультрацентрифугированием при 50000 в течение 30 мин (4 С) и нуклеопротеилов при 150000 в течение 120 мин (4 С), адсорбция НА на формалинизированные эритроциты петуха в течение 5-10 мин (4 С) с последующей его элюцией с эритроцитов в течение 4 ч (37 С) и дополнительная очистка НА через подушку 30-ной сахарозы методом ультрацентрифугирования, исследование чистоты (отсутствие внутренних компонентов вирионов),активности и специфичности полученных фракций НА Н 5 в серологических тестах, иммунизация животного-донора путм четырхкратного введения очищенного антигена(НА Н 5) в область предлопаточных лимфоузлов в возрастающих дозах в количестве от 60 до 180 мкг на животное, забор крови животного через 14 суток,получение гипериммунной антисыворотки. Техническим результатом изобретения является разработка упрощнного, относительно дешвого и технологичного способа получения моноспецифических антител к гемагглютипину Н 5 вируса гриппа А, пригодных для разработки серологических тестов, таких как РТГА и сэндвич варианты ТФ-ИФА. Приготовленные антитела используют для составления диагностических наборов, применяемых в целях диагностики и идентификации вновь выделенных изолятов вируса гриппа А с 5 подтипом НА в различных биологических образцах.(72) Матвеева Валентина Михайловна Мамадалиев Сейдигапбар Мамадалиевич Кошеметов Жумагали Каукарбаевич Ажибаев Азамат Жасуланович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К ГЕМАГГЛЮТИНИНУ Н 5 ВИРУСА ГРИППА А(57) Изобретение относится к области биотехнологии, иммунологии и ветеринарной вирусологии, точнее, к разработке средств и методов лабораторной диагностики вирусных болезней птиц. Задачей изобретения - разработка способа приготовления высокоактивных и моноспецифических антител к НА Н 5 вируса гриппа А,пригодных для идентификации вновь выделенных изолятов данного типа вируса с Н 5 подтипом НА в различных биологических образцах методами РТГА и прямого сэндвич-варианта ТФИФА, а также производства диагностических иммунореагентов (иммуноглобулины и конъюгаты) против данного подтипа НА. С целью получение очищенных препаратов белка НА Н 5, применяемого в качестве антигена для гипериммунизации коз,используют высокопатогенный штамм А/домашний гусь/Павлодар/1/05(51) вируса ГП,изолированного от погибшего домашнего гуся во время вспышки эпизоотии па территории Павлодарской области в июне 2005 года. Способ предусматривает концентрирование вируса из осветлнной аллантоисной жидкости путм осаждения его ПЭГ-6000 в 7-ной конечной концентрации при рН 8,5 в течение 24 часов (4 С) с Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии, иммунологии и ветеринарной вирусологии, а именно, к разработке средств и методов лабораторной диагностики вирусных болезней птиц. Известны способ получения моноспецифических сывороток для дифференциации возбудителей бруцеллза (Дальвадянц В.Г., Лямкин Г.И.,Ляпустина Л.В., Таран И.Ф., Луканипа Л.М.,Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт.95100388/14 А 1,27.02.1997). способ получения моноспецифических поликлональных антисывороток к антигенно родственным белкам (Баталов Т.Н., Гузова В.А.,Козлов Л.В., Маслова Ю.Ю., Алешкин В.А.,Панурина Р.Л. Государственное учреждение Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского.2001128465/14 С 2,27.10.2003). Задачей изобретения - разработка способа приготовления высокоактивных и моноспецифических антител к гемагглютинину(НА) Н 5 вируса гриппа А, пригодных для типирования вновь выделенных изолятов данного типа вируса с 5 подтипом НА в различных биологических образцах методами РТГА и прямого сэндвич-варианта РФ-ИФА, а также производства диагностических иммунореагентов(иммуноглобулины и конъюгаты) против данного подтипа НА. Техническим результатом изобретения является разработка упрощенного, относительно дешевого способа получения моноспецифических антител к гемагглютинину Н 5 вируса гриппа А, пригодных для разработки серологических тестов, таких как РТГА и сэндвич - варианты ТФ-ИФА. Отличием от вышеуказанных способов является то, что данный способ применяется к вирусу гриппа птиц. Разработанный способ позволяет получать высокоактивные и моноспецифические антитела к НА Н 5, пригодные для разработки таких серологических тестов, как реакция торможения гемагглютинации (РТГА) и сэндвич - варианты твердофазного иммуноферментного анализа (ТФИФА). Активность приготовленных данным способом моноспецифических антител к НА Н 5 составляет в РТГА 1640- 11280 и ТФ-ИФА 110240- 120480. Антиген(НА),используемый для гипериммунизации животных,получен из высокопатогенного штамма А/домашний гусь/Павлодар/1/05 (51) вируса гриппа птиц(ГП), выделенного от погибшего домашнего гуся во время вспышки эпизоотии в крестьянском хозяйстве НАН послка Голубовка Иртышского района Павлодарской области в июне 2005 года. Разработанный способ осуществляют в следующей последовательности Наработку вируссодержащей суспензии осуществляют на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) 12 сут. возраста путм инфицирования их вирусом ГП штаммом А/домашний гусь/Павлодар/1/05 (51) вируса ГП в аллантоисную полость ( П) в объме 0,2 см 3 (доза заражения зависит от титра биологической и гемагглютинирующей активности вируса),инкубирование инфицированных РКЭ в течение 3648 час при температуре (36,00,5)С и относительной влажности воздуха(555),охлаждение погибших по истечении 20-24 час. и более после заражения эмбрионов при температуре 2-4 С в течение 16-18 час, сбор и осветление вируссодержащей аллантоисной жидкости (АЖ) с помощью низкоскоростного центрифугирования при 3000 об/мин (бакетный ротор -4.2,низкоскоростная центрифуга 16-фирмы) в течение 20 мин (4 С),определение гемагглюгинирующей активности в осветлнной АЖ производили микрометодом реакции гемагглютинации (РГА) по общепринятой методике. Приготовление очищенного вирусного концентрата Вирус из осветлнной АЖ концентрируют путем осаждения его полиэтиленгликолем с молекулярной массой 6000 кДа (ПЭГ-6000) в конечной концентрации 7 (рН суспензии подводили до 8,5) в течение 24 час (4 С) с последующим разделением осажденного вируса от надосадочной жидкости центрифугированием при 5000(бакетный ротор-4.2, низкоскоростная центрифуга 16-фирмы) в течение 60 мин (4 С). Затем вирус подвергают ультрацентрифугированию при 106000(ротор-32 , ультрацентрифуга Т-80 ХР фирмы) в течение 120 мин при 4 С. Осадок вируса гомогенизируют и осветляют центрифугированием при 5000 в течение 10 мин (4 С). Далее, вирус очищают в ступенчатом градиенте (20-60) плотности сахарозы методом ультрацентрифугирования. Очищенный вирус ресуспендируют в 100 кратном, от первоначального,объме стерильного 0,05 М раствора фосфатносолевого буфера (ФСБ), рН 7,2-7,4. В очищенных препаратах вируса определяют гемагглютинирующую активность, концентрацию белка и исследуют с целью контроля чистоты и нативности в электронном микроскопе ЕМ-100 СХ(Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении х 100000. Выделение и очистка гемагглютинина Н 5 Очищенный вирус разрушают твин-эфиром в соотношении - 11 с последующим удалением неразрушенных вирионов ультрацентрифугированием при 50000 в течение 30 мин (4 С) и нуклеопротеидовпри 150000 в течение 120 мин (4 С). Далее проводится адсорбция НА на формалинизированные эритроциты петуха в течение 5-10 мин (4 С) с последующей его элюцией с эритроцитов в течение 4 ч (37 С) и дополнительная очистка НА через подушку 30 ной сахарозы. Активность, выделенного данным способом НА Н 5, в РГА составляет -12048-4096. 2 Концентрацию белка в очищенных препаратах НА определяют по методу Лоури, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин фирмы(США). Количество белка в препаратах НА в наших опытах составляло 90-120 мкг/мл. Отсутствие в составе полученных препаратов НА Н 5. Из каких-либо примесей внутренних компонентов вирионов подтверждали с помощью тест-системыА фирмы(США). Получение гипериммунной антисыворотки к гемагглютинину Н 5. Гипериммунную антисыворотку к 5 подтипу НА получали на козах местной породы, вследствие того,что использование высокоспецифичных антисывороток, полученных от этих животных рекомендовано экспертами Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) для уверенного антигенного субтипирования и идентификации вируса гриппа А,так как они дают самые минимальные неспецифические реакции. Для этого козам в качестве антигена вводили очищенные препараты данного белка. Схема гипериммунизации коз состояла из 4 введений антигена в возрастающей дозе в область предлопаточных лимфоузлов с интервалом между введениями в 2-3 недели. Оценку активности и специфичности полученной гипериммунной антисыворотки проводили в РТГА и непрямом ТФ-ИФА. Активность полученных антисывороток составляла в РТГА 1640-11280 и ТФ-ИФА 110240- 120480 соответственно. Приготовленные сыворотки обладали типоспецифичностью и позволяли выявлять антиген подтипа Н 5 в любых клинических материалах при отрицательных результатах в пробах гомологичного ряда подтипов Н 6 и Н 7 вируса гриппа птиц и отрицательных антигенах. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения моноспецифических антител к гемагглютинину Н 5 вируса гриппа А, включающий наработку высокоактивной суспензии вируса ГП в АП 12 сут РКЭ, приготовление очищенного вирусного концентрата, выделение и очистку антигена, гипериммунизацию доноров антигеном,обескровливание животного по истечении 14 дней после последней инъекции и отделение сыворотки,отличающийся тем, что в качестве доноров моноспецифических антител используют коз,которых иммунизируют подкожно в область предлопаточных лимфатических узлов очищенным белком-антигеном (НА Н 5) четырехкратно, с интервалом между введениями в 2-3 недели, причем в целях повышения иммуногенеза при 2 введении используют сапонин в 0,5 конечной концентрации.