Способ получения антигенного эритроцитарного диагностикума для выявления специфических антител к вирусу гриппа а (н5n1) в рнга

(51) 01 33/531 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Задача изобретения - разработка способа получения антигенного эритроцитарного диагностикума для обнаружения специфических антител к вирусу гриппа(51) при помощи конъюгирующего агента метола. Сущность изобретения. Способ осуществляют следующим образом 2 объема 10 взвеси формалинизированных эритроцитов барана смешивают с 1 объемом очищенного,инактивированного вируса гриппа(51) в концентрации 50-75 мкг/мл и при периодическом встряхивании инкубируют в водяной бане при 52 С в течение 40 мин в присутствии 1 объема 1 водного раствора метола. Использование 0,075 раствора тритона Х-100 на этапах отмывки и приготовления 1 взвеси сенсибилизированных эритроцитов обеспечивает высокую чувствительность и четкие контроли реакции непрямой гемагглютинации. Положительный эффект. Разработан эффективный способ приготовления иммунореагентов для серологической диагностики вируса гриппа птиц в реакции непрямой гемагглютинации, совмещающий в себе высокую чувствительность и простоту постановки реакции.(72) Асанова Сауле Естаевна Ишмухаметова Наиля Галивеевна Карамендин Кобей Омертаевич Кыдырманов Айдын Исагалиевич Жуматов Кайнар Хамзаевич Саятов Марат Хусаинович(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Центр биологических исследований Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГРИППА А (51) В РНГА(57) Изобретение относится к области ветеринарии,в частности к вирусологии, а именно к способам разработки эффективных методов, предназначенных для ускоренной серологической диагностики вирусных инфекций. 20842 Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к вирусологии, а именно к способам разработки эффективных методов, предназначенных для ускоренной серологической диагностики вирусных инфекций. Известны способы приготовления диагностических препаратов путем сенсибилизации эритроцитов различными антигенами при помощи танина, глутарового альдегида, амидола, риванола,хлорида хрома, диаминодифениламина, бромциана и бидиазотированного бензидина (Корнеева, 1977 Дяченко, 1979 Каральник, 1995). Известен метод обнаружения антител к вирусу гриппа птиц (ВГП) с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА), но постановка данной реакции требует постоянного подбора рабочей дозы антигена и наличия свежих эритроцитов (, 2002). Известны методы выявления антител к вирусу гриппа иммуноферментными методами (, фирмыи Набор для планшетного ИФА фирмы ). Уровень техники. Недостатками известных способов приготовления препаратов является трудоемкость в исполнении,низкая чувствительность, а также разработанные с их помощью диагностические средства весьма дорогостоящи, что ограничивает их широкое использование. Известны способы получения антительных эритроцитарных диагностикумов(ЭД),для определения орто- и арбовирусов, а также вируса гриппа в биологических материалах в реакции непрямой гемагглютинации(РНГА),путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана противогриппозными антителами с помощью конъюгирующего агента метола (А.с. СССР, 1817026, 01 33/ 531, 1993).(Багашева С. и др., 1992 Жуматов К.Х. и др., 1994). Метол в качестве химического посредника в процессе приготовления антигенных диагностикумов для определения противогриппозных антител в РНГА до настоящего времени не применялся. Задачей изобретения является разработка способа получения антигенного ЭД для обнаружения специфических антител к вирусу гриппа (51) при помощи конъюгирующего агента метола. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении высокочувствительного и специфичного иммунореагента для серологической диагностики вируса гриппа /51 в РНГА с помощью более доступной и совершенной методики. Сущность изобретения. Способ осуществляют следующим образом 2 объема 10 взвеси формалинизированных эритроцитов барана смешивают с 1 объемом очищенного,инактивированного вируса гриппа А/Лебедь шипун/Актау/1460/06 (51) в концентрации 50-75 мкг/мл и при периодическом встряхивании инкубируют в водяной бане при 52 С в течение 40 мин в 2 присутствии 1 объема 1 водного раствора метола. Использование 0,075 раствора тритона Х-100 на этапах отмывки и приготовления 1 взвеси сенсибилизированных эритроцитов обеспечивает высокую чувствительность и четкие контроли РНГА. Пример 1,К 1,0 мл 10 взвеси формалинизированных эритроцитов барана добавляют 0,5 мл суспензии инактивированного вируса гриппа А/Лебедь шипун /Актау/1460/06 с содержанием белка 50-75 мкг/мл и 0,5 мл 1 водного раствора метола смесь инкубируют при 52 С в течение 40 мин при периодическом встряхивании. Сенсибилизированные таким образом эритроциты трижды отмывают 5 мл забуференного физиологического раствора (ЗФР) с рН 7,2,содержащего тритон Х-100 в 0,075 концентрации. Конечная концентрация эритроцитов в готовом ЭД составляет 1. Пример 2. Диагностикумы на основе инактивированного вируса гриппа(51) готовят в условиях описанных в примере 1. Варьируют только значения концентраций антигена (25 мкг/мл,50 мкг/мл, 75 мкг/мл, 100 мкг/мл). РНГА ставится с гипериммунной кроличьей сывороткой, содержащей антигемагглютинины к вирусу гриппа(51) в титре 11280. Панели оставляются при комнатной температуре(1822 С) до полного оседания эритроцитов в контрольных лунках. Результаты реакции представлены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, ЭД приготовленные с антигенами в концентрациях 50 мкг/мл и 75 мкг/мл позволяют обнаружить антитела в иммунной сыворотке в титрах 10,320,0 в то время как концентрация 25 мкг/мл не сенсибилизирует формалинизированные эритроциты барана, а 100 мкг/мл вызывает спонтанную агглютинацию в контрольных лунках. Таким образом, максимальная чувствительность индикации антител обеспечивается ЭД с содержанием белка 50 -75 мкг/мл. Пример 3. В условиях, описанных в примере 1,изготавливаются антигенные ЭД, варьируют только значения температуры инкубации (45 С, 52 С и 60 С) и концентрации метола (0,5, 1,0 и 1,5). Результаты РНГА показаны в таблице 2. Из таблицы 2 видно, что максимальные титры антител к ВГП выявляются с ЭД, приготовленным при 52 С в присутствии метола в 1 концентрации. Использование 0,5 и 1,5 растворов при температуре инкубации 45 С и 60 С приводит к снижению титров РНГА. Пример 4. Влияние продолжительности сенсибилизации эритроцитов барана вирусным антигеном на чувствительность ЭД изучают в условиях описанных в примере 1. Для этого смесь формалинизированных эритроцитов барана,сенситина и конъюгата инкубируют при 52 С в течение 30, 40 и 60 мин. В результате исследований установлено, что наиболее высокие титры антител выявляются при 40 мин экспозиции ингредиентов реакции. 20842 Пример 5. Осуществляется подбор оптимального стабилизатора для отмывания сенсибилизированных эритроцитов и постановки, РНГА. Эритроциты барана, нагруженные гриппозным антигеном при помощи метола по технологии,описанной в примере 1, отмывают рабочими разведениями различных реагентов нормальной кроличьей сывороткой, нормальной лошадиной сывороткой, бычьим сывороточным альбумином,твином-80, тритоном Х-100, сывороткой крупного рогатого скота и ЗФР. Результаты этих исследований представлены в таблице 3. Как видно из таблицы 3, чувствительность ЭД зависит от вида присутствующего стабилизирующего агента. Так, при использовании 1 нормальной лошадиной сыворотки и 0,1 бычьего сывороточного альбумина сенсибилизированные антигеном эритроциты выявляют соответствующие антитела в титрах 8,320,0. В то же время эритроциты, отмытые ЗФР,содержащим тритон Х-100 или твин-80, выявляют антитела в титрах 10,320,0 и 9,320,0,соответственно, что превышает показатели РТГА в 2-4 раза. 1 нормальная кроличья сыворотка обеспечивает равную с твин-80 чувствительность РНГА. Непригодны для отмывания сенсибилизированных при помощи метола эритроцитов 1 нормальная сыворотка крупного рогатого скота и ЗФР без какого-либо стабилизирующего агента. Пример 6. Контроль специфичности иммунореагентов, приготовленных в условиях описанных в примере 1, осуществляется с иммунными сыворотками к вирусу гриппа Как видно из таблицы 4, антигенный ЭД к ВГП взаимодействует только с гомологичной сывороткой в титре 10,320,0 и не реагирует со всеми другими взятыми в опыт сыворотками. Практическое испытание эффективности полученного антигенного ЭД проводится в РТГА и РНГА, изучены 30 проб сывороток крови различных видов диких птиц Алматинского зоопарка,привитых иммунизированной эмульгированной вакциной против гриппа птиц (ОАО Покровский завод биопрепаратов, Россия, регистр, номер ПВР 1-3,5/01517). Результаты отражены в таблице 5. Из табл. 5 видно, что в сыворотках крови вакцинированных птиц титры специфических антител к вирусу гриппа(51) в РТГА колеблются в пределах 4,320,0 - 10,320,0, в то время как в РНГА с антигенным ЭД,приготовленным по разработанному нами методу,антитела обнаруживаются в более высоких титрах и составляют 5,320,0 - 11,320,0. Полученные данные свидетельствуют о возможности использования РНГА с предлагаемым нами антигенным ЭД для определения противогриппозных антител в сыворотках крови вакцинированных птиц. Сравнительные исследования результатов метода с общепринятой РТГА показали равные возможности обнаружения антител при использовании обоих методов (РНГА и РТГА). Однако, благодаря превышающей в 4-8 раз чувствительности,постановка РНГА по предлагаемому нами способу более приемлема для диагностики гриппа птиц. По мнению специалистов ветеринарной лаборатории Алматинского зоопарка, полученный диагностикум высоко чувствителен и специфичен. Реакция с указанным препаратом легко воспроизводима и может быть использована в условиях быстрого развертывания лаборатории в полевых условиях. Таблица 1 Эффективность сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана в зависимости от концентрации инактивированного вируса гриппа А/лебедь шипун/Актау/1460/06 Концентрация антигена (мкг/мл) Титр антител в РНГА с ЭД к ВГП 25 0 50 10,320,0 75 10,320,0 100 СП Примечание - СП - здесь и в таблицах 2,3,4,5 спонтанная агглютинация,- здесь и в таблицах 2,3, 4,5, среднегеометрические титры антигемагглютининов в 2. Таблица 2 Влияние концентрации метола и температуры инкубации на чувствительность антигенных ЭД Температура инкубации (С) 45 52 60 Титр антител к ВГП в РНГА с ЭД, приготовленными при помощи метола в концентрациях 0,5 1,0 1,5 8,320,0 8,980,47 8,650,47 9,320,0 9,980,47 8,320,0 8,980,47 9,320,0 СП 3 Таблица 3 Влияние стабилизирующих агентов на чувствительность антигенного ЭД к вирусу гриппа(51) в РНГА Стабилизатор Титр антител к вирусу гриппа А (51) 1 нормальная кроличья сыворотка 9,320,0 1 нормальная лошадиная сыворотка 8,320,0 0,1 бычий сывороточный альбумин 8,320,0 0,02 твин-80 9,320,0 0,01 тритон Х-100 10,320,0 1 сыворотка крупного рогатого скота СП ЗФР рН-7,2 СП Таблица 4 Оценка специфичности антигенного ЭД к вирусу гриппа А (51) Сыворотка к вирусам Титр антител в РНГА Гриппа(51) 10,320,0 Ла Сота 3,320,0 Инфекционной бурсальной болезни 3,320,0 Юкейпа/56 3,320,0 Инфекционного ларинготрахеита 3,320,0 Нормальная сыворотка курицы 3,320,0 Нормальная сыворотка кролика 3,320,0 Таблица 5 Титры антител в РТГА и РНГА в сыворотках крови птиц,иммунизированных вакциной 5/ Вид птицы Титр антител в РТГА РНГА 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 4 2 Лебедь кликун Канадская казарка Гусь серый Сухонос Сухонос Лебедь кликун Лебедь кликун Канадская казарка Сухонос Гусь серый гибрид Сухонос Лебедь шипун Канадская казарка Сухонос 2 Лебедь тундровый Сухонос Канадская казарка Гусь горный Гуменник Гусь горный Гусь Сухонос Гуменник Королевский фазан Королевский фазан Королевский фазан Королевский фазан Королевский фазан Королевский фазан Королевский фазан ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигенного эритроцитарного диагностикума для выявления специфических антител к вирусу гриппа А (Н 51) путем сенсибилизации эритроцитов инактивированным вирусом в присутствии конъюгирующего агента, 7,3200 8,320,0 7,320,0 7,650,47 отличающийся тем,что для получения высокочувствительного иммунореагента при температуре инкубации 52 С применяют сочетанное использование 1,0 водного раствора метола в качестве химического посредника и 0,075 раствор тритона Х-100 в качестве стабилизатора.