Способ приготовления антигенного эритроцитарного иммунореагента для серологической диагностики инфекционной бурсальной болезни птиц

(51) 01 33/531 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ иммунореагента для серологической диагностики инфекционной бурсальной болезни птиц в реакции непрямиой гемагглютинации Сущность изобретения заключается в том, что при сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана антигеном из вакцинного штамма вируса инфекционной бурсальной болезни в качестве посредника используют 1,5 раствор метола, отмывание и суспендирование нагруженных вирусом эритроцитов проводят забуференным физиологическим раствором (рН-7,2), содержащим тритон Х-100 в 0,015 концентрации. Исследуемые на наличие специфических антител сыворотки готовят в растворе такого же состава. Оптимальной температурой получения эритроцитарного диагностикума является 50 С. Положительный эффект. Разработан метод получения высокочувствительной диагностической тест-системы к вирусу инфекционной бурсальной болезни,характеризующийся высокой чувствительностью (в 8-16 раз) и низкой стоимостью исследований по сравнению с традиционными реакцией диффузной преципитации и иммуно-ферментным анализом, соответственно.(72) Асанова Сауле Естаевна Ишмухаметова Наиля Галивеевна Карамендин Кобей Омертаевич Кыдырманов Айдын Исагалиевич Жуматов Кайнар Хамзаевич Саятов Марат Хусаинович(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Центр биологических исследований Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ АНТИГЕННОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО ИММУНОРЕАГЕНТА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ПТИЦ(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к разработке методов экспресс-диагностики вирусных инфекций птиц. Задача изобретения - разработка способа приготовления антигенного эритроцитарного 20843 Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к разработке методов ускоренной серологической диагностики вирусных инфекций птиц. Известен метод диагностики инфекционной бурсальной болезни (ИББ) в реакции диффузионной преципитации (РДП), характеризующийся низкой чувствительностью и трудоемкостью исполнения( .,, 1985). Известны также иммуноферментные тестсистемы, позволяющие идентифицировать антитела к вирусу ИББ в сыворотках крови птиц, однако их широкое применение ограничивается высокой стоимостью препарата ( ,.,, 1992) Известны способы лабораторной диагностики вирусных инфекций птиц, основанные на выявлении прироста титров специфических антител в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при помощи эритроцитарных диагностикумов (ЭД). К ним относятся методы сенсибилизации эритроцитов различными антигенами с помощью танина,глутарового альдегида, амидола, риванола и др.(Дяченко, 1979 Каральник, 1995). Однако эти методы получения иммунореагентов либо трудоемки в исполнении, либо не обеспечивают высокой чувствительности реагентов. Уровень техники. Недостатками известных способов приготовления препаратов является трудоемкость в исполнении,низкая чувствительность, а также разработанные с их помощью диагностические средства весьма дорогостоящи, что ограничивает их широкое использование. В лаборатории экологии вирусов ДГП Институт микробиологии и вирусологии РГП Центр биологических исследований КН МОН РК предложен простой и рентабельный способ приготовления антительных ЭД для индикации орто- и арбовирусов в биологических материалах к антигенный ЭД для определения антител к вирусу болезни Ньюкасла в РНГА путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана специифическими глобулинами и парамиксовирусными антигенами в присутствии конъюгирующего агента метола (Багашева и др., 1992 Жуматов и др., 1994 А.с. СССР, 1817026, 01 33/531, 1993 А.с. РК 20331,33/531, 1997),Этот реагент в качестве химического посредника в процессе приготовления антигенных ЭД для выявления антител и оценки напряженности иммунитета к ИББ в РНГА до настоящего времени не применялся. Задачей изобретения является разработка метода получения высокочувствительного антигенного иммунореагента, предназначенного для серологической диагностики ИББ в РНГА с использованием в качестве посредника метола. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении высокочувствительного и специфичного иммунореагента 2 для серологической диагностики вируса гриппа/51 в РНГА с помощью более доступной и совершенной методики. Сущность изобретения заключается в том, что при сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана антигеном из вакцинного штамма вируса ИББ в качестве посредника используют 1,5 раствор метола, отмывание и суспендирование нагруженных вирусом эритроцитов проводят забуференным физиологическим раствором(ЗФР) рН-7,2,содержащим тритон Х-100 в 0,015 концентрации. Исследуемые на наличие специфических антител сыворотки готовят в растворе такого же состава. Отличительными признаками изобретения являются применение ранее неиспользованных при подготовке антигенных ЭД к вирусу ИББ конъюгирующего агента метола в концентрации 1,5, стабилизирующего агента тритона Х-100 в 0,015 концентрации и температуры инкубации 50 С. Предварительно подбирали оптимальный носитель антигена вируса ИББ, не агглютинирующий компоненты нормальной сыворотки крови птиц и тем самым обеспечивающий специфичность РНГА. Из испытанных формалинизированных кровяных клеток(барана, лошади, курицы и индюка) наиболее оптимальными оказались эритроциты барана,агглютинирующие лишь некоторые сыворотки крови кур в титрах 12-14. Способ осуществляют следующим образом к одному объему 10 взвеси формалинизированных эритроцитов барана добавляют равный объем суспензии антигена вируса ИББ с содержанием белка 50 мкг/мл и 0,5 объема 1,5 водного раствора метола. Смесь инкубируют в водяной бане при 50 С в течение 60 мин., периодически встряхивая. Сенсибилизированные таким образом эритроциты трижды отмывают ЗФР с рН 7,2, содержащим тритон -100 в 0,015 концентрации, и разводят в том же растворе до 1 конечной концентрации. Пример 1. К 1 мл 5, 10 и 15 взвеси формалинизированных эритроцитов барана добавляют по 0,5 мл 1, 1,5 и 2 водного раствора метола и 1 мл сенситина с содержанием белка 50 мкг/мл. Смеси выдерживают 60 мин при 50 С, периодически встряхивая. Нагруженные сенситином эритроциты трижды отмывают 5 мл ЗФР(рН 7,2), содержащего тритон Х-100 в 0,015. Конечная концентрация эритроцитов в приготовленном ЭД составляет 1. Из данных представленных в табл. 1 видно, что из испытанных концентраций эритроцитов и метола оптимальными являются 10 и 1,5,соответственно. Пример 2, Сенсибилизирующее действие антигена вируса ИББ из вакцинных препаратов от различных производителей,применяемых в птицеводческих хозяйствах Казахстана,устанавливают по методике описанной в примере 1. Для приготовления антигенного ЭД использовали 1.Сухую вирусвакцину против инфекционной 20843 бурсальной болезни из штамма БГ (ВНИИЗЖ МСХ РФ) 2. Сухую вирусвакцину против инфекционной бурсальной болезни (Германия) 3. Живую вакцину против инфекционного бурсита(штамм 1-65 , Израиль). Предварительно вакцинные препараты растворяют в 2 мл стерильной дистиллированной воды и устанавливают сенсибилизирующее действие каждого антигена в зависимости от содержания белка в препарате. В качестве конъюгирующего агента служит метол. Чувствительность РНГА определяют при помощи положительной сыворотки, содержащей антитела к вирусу ИББ в титре 9,40,5 (табл. 2). Как видно из таблицы 2, антиген из вакцины израильского производства) непригоден для приготовления ЭД, так как в испытанных концентрациях вызывает спонтанную агглютинацию эритроцитов во всех лунках, включая контрольные. Вакцина российского производства, с содержанием белка 30-75 мкг/мл, обеспечивает получение ЭД, выявляющих специфические антитела в РНГА в титрах 4,00,0- 5,00,0, в то время как реагенты, приготовленные на основе вакцины германского производства, позволяют обнаруживать специфические антитела в сыворотке крови в титрах 6,20,4 - 9,40,5. Дальнейшие разработки по конструированию ЭД для серологической диагностики ИББ в РНГА проводили на основе антигенов из вакцины производства Германии с содержанием белка в концентрации 50 мкг/мл. Пример 3. Антигенные ЭД к вирусу ИББ готовят в режиме, указанном в примере 1, варьируя температурой и продолжительностью инкубации 45 С, 52 С и 60 С в течение 40, 60 и 90 мин при периодическом встряхивании. РНГА ставят с иммунными сыворотками цыплят, содержащими антитела к вирусу ИББ в титре 9,40,5. Панели оставляют при комнатной температуре (18-22 С) до полного оседания эритроцитов в контрольных лунках. Результаты реакции представлены в таблице 3. Из таблицы 3 видно, что максимальные титры антител к вирусу ИББ выявляются с ЭД,приготовленными при 50 С и продолжительности инкубации 60 мин. Инкубирование при 45 и 60 С в течение 40 и 90 мин приводит к снижению титров РНГА или к спонтанной агглютинации эритроцитов. Пример 4. Для оценки эффективности предлагаемого способа приготовления антигенного эритроцитарного иммунореагента для серологической диагностики ИББ проводят сравнительную оценку чувствительности препаратов, полученных разработанным нами и ранее известными методами (с помощью танина,глутарового альдегида и риванола). Наибольшие титры антител к вирусу ИББ в РНГА отмечены при использовании ЭД,приготовленных при помощи метола в качестве посредника. Эти препараты обнаруживают специфические антитела в иммунной сыворотке в титрах 9,40,5 , в то время как диагностикумы па основе танина, глутарового альдегида и риванола выявляют последние в титрах 7,30,3, 8,30,5 и 5,00,0, соответственно. Пример 5. Испытание чувствительности антигенного ЭД полученного по способу,описанному в примере 1, в РНГА в сравнении с традиционной РДП проводят с сыворотками крови пяти цыплят, иммунизированных инактивированной вакциной фирмы(Германия). Результаты серологических исследований отражены в таблице 3. Из таблицы 3 видно, что в сыворотках крови вакцинированных птиц специфические антитела к вирусу ИББ в РНГА с ЭД обнаруживаются в титрах 8,00,0- 9,10,2, в РДП - 2,00,0 - 5,00,0, т.е. титры специфических антител выявляемые в РНГА,превосходят таковые в традиционной РДП в 8 -16 раз. Пример 6. Контроль специфичности эритроцитарного иммунореагента, приготовленного по способу предлагаемому в примере 1,осуществляют с иммунными сыворотками к вирусам болезни Ньюкасла,инфекционного ларинготрахеита, оспы кур и не иммунными сыворотками курицы и кролика. Антигенный ЭД к вирусу ИББ реагирует только с гомологичной сывороткой в титрах 8,00,0-9,10,2 и не взаимодействует со всеми другими, взятыми в опыт коммерческими сыворотками. Полученные данные позволяют рекомендовать антигенный ЭД, приготовленный по разработанной нами технологии,для определения противовирусных антител к вирусу ИББ в сыворотках крови вакцинированных птиц в РНГА. Метод прост в исполнении, не требует больших затрат времени и может быть внедрен в практические вирусологические лаборатории. Серологическое обследование сывороток крови птиц на наличие специфических антител занимает важное место при изучении напряженности поствакцинального иммунитета среди домашних птиц. При помощи антигенного ЭД, приготовленного по разработанному методу, исследованы сыворотки крови от 110 иммунизированных против ИББ цыплят 1-, 14-, 40- 70- и 90- дневных возрастов из птицефабрики ТОО Алтын Ай, расположенной в пригороде г. Алматы, (табл. 3). При сравнительном изучении сывороток крови выявлено, что у цыплят однодневного возраста,содержащих лишь материнские антитела, их титры в РНГА либо не выявляются, либо колеблются в пределах 2,10,6, в то время как таковые у 14, 40, 70 и 90- дневных птиц, иммунизированных в возрасте 2-х и 17 дней, - составляют 5,00,0 9,40,5, 8,30,5 и 7,30,4, соответственно. Проведенные исследования показывают эффективность использования предлагаемого нами антигенного ЭД для оценки напряженности специфического иммунитета при ИББ в РНГА. Преимущество предлагаемого способа приготовления ЭД заключается в том, что он обеспечивает получение препаратов высокой 3 20843 чувствительности и специфичности, позволяющие рекомендовать их для учреждений ветеринарного Таблица 1. Подбор оптимальных концентраций метола и формалинизированных эритроцитов барана при конструировании антигенного ЭД к вирусу ИББ Концентрация метола Титр антител в РНГА в зависимости от концентрации эритроцитов (в )(в ) 5 10 15 1 5,00,0 8,00,0 6,20,4 1,5 6,20,4 9,10,2 7,80,6 2 4,50,5 7,30,4 5,50,5 Таблица 2. Подбор оптимальной концентрации вируса ИББ в качестве сенситина при изготовлении антигенного ЭД Концентрация Титр антител к вирусу ИББ с ЭД, приготовленными при помощи метола с антигена вакцинными препаратами производства(мкг/мл) России Израиля Германии 20 СП СП СП 30 4,00,0 СП 6,20,4 50 5,00,0 СП 9,40,5 75 4,50,5 СП 8,30,5 Примечание - СП - здесь и в таблице 3 спонтанная агглютинация Таблица 3 Влияние продолжительности и температуры инкубации на чувствительность ЭД в РНГА Температура инкубации (С) Титр антител с ЭД при продолжительности инкубации (в мин) 40 60 90 45 7,30,4 7,80,3 6,20,4 50 8,30,5 9,40,5 7,30,4 60 6,20,4 7,30,3 СП Таблица 4 Сравнение чувствительности РНГА с ЭД и РДП при постановке реакции с иммунными сыворотками цыплят к вирусу ИББ/ сывороток от Титр антител в цыплят РНГА РДП 1 9,1 0,2 5,00,0 2 9,40,5 5,00,0 3 8,10,3 3,750,0 4 8,00,0 2,10,6 5 8,30,5 2,00,0 Таблица 5 Среднегеометрические титры антител к вирусу ИББ в РНГА в сыворотках крови вакцинированных домашних птиц Возраст цыплят (в днях) Число обследованных птиц Титр антител в 1 15 2,1 0,6 14 25 5,00,0 40 25 9,40,5 70 25 8,30,5 90 20 7,30,4 Всего 110 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ приготовления антигенного эритроцитарного иммунореагента для серологической диагностики инфекционной бурсальной болезни птиц путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана специфическим антигеном, отличающийся тем, что в качестве химического посредника используют 1,5 водный раствор метола, в качестве стабилизатора - 0,015 раствор тритона Х-100 и температуру инкубации 50 С.