Фармацевтическая субстанция соли аминокислоты L-лизина и эсцина

(51) 61 31/704 (2006.01) 61 31/195 (2006.01) 61 7/10 (2006.01) 61 9/14 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(74) Ляджин Владимир Алексеевич Русакова Нина Васильевна Жукова Галина Алексеевна(56) Инструкция для медицинского применения препарата-лизина эсцината. Корпорация тм, утв.приказом МЗ Украины 319 от 17.06.2088(54) ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ СУБСТАНЦИЯ СОЛИ АМИНОКИСЛОТЫ -ЛИЗИНА И ЭСЦИНА(57) Фармацевтическая субстанция, которая представляет собой соль аминокислоты -лизина и эсцина, при этом эсцин представляет собою смесь эсцина а, эсцина , изоэсцина а и изоэсцина , где соотношения суммы эсцина а и эсцинак сумме изоэсцина а и изоэсцинасоставляет 2,0-9,08,01,0.(72) Гарцылов Денис ВасильевичТкачук Юрий ЮриевичКолодий Игорь Петрович Блонский Александр ВладимировичКравчук Жанна НиколаевнаНикитина Виталина НиколаевнаКувайсков Юрий ГеннадиевичСур Сергей ВладимировичКушнир Наталия Александровна(73) Корпорация АРТЕРИУМАкционерное общество открытого типа Галичфарм Изобретение касается медицины и фармации, а именно получения новых лечебных средств,которые используют для лечения патологических состояний, которые сопровождаются явлениями отека и/или набухания головного и/или спинного мозга разной степени тяжести отеками мягких тканей, в том числе с привлечением опорнодвигательного аппарата. Известные лечебные средства на основе сапонина каштана конского - эсцина, в частности Аэсцина, которые имеют противоотечное действие инструкция для медицинского применения препарата АЭСЦИН,, Польша. Известные свойства эсцина снижать сосудистую проницаемостьН.,.,Т.,К.,., ., , ,,.,. //. 1997 )20(10)1092-5, за счет стабилизации ендотелиоцитовТ.,.,С., .. //. 199614315(2)227-33. Также известно применение водорастворимой соли эсцина,а именно натрия эсцината, в виде внутривенных инъекций при лечении черепно-мозговой травмы,которая сопровождается отеком мозгаТ.. 1979121(31) 1019-22, а также при лечении посттравматических и постоперационных отеков мягких тканейК,С.-.-( ).. 19751970(51-52)2079-83. Положительные результаты такого лечения были подтверждены результатами клинических исследований. Кроме того,по данным экспериментальных и клинических исследований,препараты эсцина имеют не только противоотечное,но и противовоспалительное и обезболивающее действие,. //. - 2001 . - 49(5). Наиболее близким к заявленному изобретению является препарат -лизина эсцината инструкция для медицинского применения препарата -лизина эсцината, Корпорация Артерум, Украина,который содержит соль аминокислоты -лизина и эсцина,и пропиленгликоль и проявляет противовоспалительное,противоотечное и обезболивающее действие. Недостатком использования данного препарата является узкий терапевтический диапазон, что обуславливает риск возникновения побочных реакций, таких как флебит и гемолиз, при введении терапевтической дозы, что составляет 5-10 мл, и низкую эффективность при применении меныпых доз. Изложенное выше обосновывает целесообразность получения лечебного средства,которое проявляет большее противоотечное и противовоспалительное действие и имеет более безопасный терапевтический профиль по сравнению с существующим аналогом. В основу изобретения положена задача разработать фармацевтическую субстанцию и приемлемую фармацевтическую композицию путем использования существующих разновидностей эсцина,которая будет иметь выраженное противоотечное действие в сочетании с противовоспалительным и обезболивающим действием и уменьшенной частотой развития побочных реакций по сравнению с существующим аналогом. Решение поставленной задачи обеспечивает получение соли аминокислоты - лизина и смеси тритерпеновых сапонинов, а именно эсцина а,эсцина , изоэсцина а, изоэсцина(суммарный эсцин), которые получают из плодов каштана видов,,или. . Неожиданно мы определили,что терапевтический эффект соли аминокислоты лизина и эсцина зависит от соотношения суммы эсцина а и эсцина(-эсцина) к сумме изоэсцина а и изоэсцина(-эсцина), а именно использования суммарного эсцина с соотношением-эсцина к -эсцину 2-98-1 для получения соли аминокислоты -лизина и суммарного эсцина с заданным соотношением компонентов, а также исключение пропиленгликоля из состава фармацевтической композиции, что позволяет достигнуть лучшего терапевтического эффекта от ее применения и обеспечить меньшую частоту побочных реакций по сравнению с аналогом. Субстанцию соли -лизина и суммарного эсцина с заданным соотношением -эсцина к -эсцину) получают путем использования коммерчески доступных субстанций -лизина, эсцина а, эсцина, США, , США. Кроме того,можно выделить как суммарный эсцин, так и отдельные субстанции эсцина а, эсцина ,изоэсцина а и изоэсцинаиз плодов каштана видов,,или.любым путем, которые описаны, например, в 3,163,636, 1961 /,.. . 44 (1996) 1454-1464. Способ получения соли аминокислоты -лизина и суммарного эсцина с заданным соотношением эсцина к -эсцину происходит по той самой схеме,что и способ получения соли аминокислоты лизина и эсцина, который известен из патента Украины 22509 от 22.05.1997, с тем отличием, что использованная субстанция эсцина уже имеет заданное соотношения -эсцина к -эсцину. Субстанцию суммарного эсцина с заданным соотношением -эсцина к -эсцину получают общеизвестными среднему специалисту методами в данной области техники, например, путем смешения с заданным соотношением субстанций -эсцина и эсцина или путем стандартизации субстанции эсцина путем смешения разных серий субстанций эсцина и/или дополнительного введения -эсцина или -эсцина для достижения их заданного соотношения. Для проверки наличия вышеуказанного технического результата были поставлены эксперименты, которые отображены в примерах ниже. Пример 1. Получение первичных растворов Для получение тестовых растворов использованы коммерческие субстанции -эсцина и Р-эсцина (.,Китай),субстанция-лизина,чистый пропиленгликоль, 96 этанол, 0,9 раствор натрия хлорида и вода для инъекций. Первичные растворы соли -лизина и а-эсцина и соли -лизина и -эсцина получали путем растворения 150 мг (точное взвешивание при перерасчете на 100 вещество) соответствующей субстанции эсцина (а- или р-) в 3 мл 0,646(/) раствора основы -лизина (при комнатной температуре, при необходимости растворения субстанции эсцина использовали ультразвуковую баню). Раствор 1. Первичный раствор соли -эсцина и-лизина доводили изотоническим раствором натрия хлорида до 15 мл. Раствор 2. Первичный раствор соли -эсцина и-лизина доводили изотоническим раствором натрия хлорида к 15 мл. Раствор 3. 10 мл раствора 1 доводили изотоническим раствором натрия хлорида до 100 мл с последующей стерильной фильтрацией. Раствор 4. 10 мл раствора 2 доводили изотоническим раствором натрия хлорида до 100 мл с последующей стерильной фильтрацией. Раствор 5. До 1 мл раствора 1 прибавляли 2 мл чистого пропиленгликоля и доводили объем водой для инъекций до 10 мл с последующей стерильной фильтрацией. Раствор 6. К 1 мл раствора 2 прибавляли 2 мл чистого пропиленгликоля и доводили объем водой для инъекций до 10 мл с последующей стерильной фильтрацией. Раствор 7. К 4 мл раствора 1 прибавляли 8 мл 96 этанола и доводили объем водой для инъекций до 10 мл с последующей стерильной фильтрацией. Раствор 8. К 4 мл раствора 2 прибавляли 8 мл 96 этанола и доводили объем водой для инъекций до 10 мл с последующей стерильной фильтрацией. Пример 2. Изучение противоотечной активности субстанций солей -лизина и суммарного эсцина с различными соотношениями -эсцина и -эсцина. Исследования проводились на 110 белых крысахсамцах линии Вистар массой 120-160 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария. В каждой труппе было по 10 животных, которые различались метками, нанесенными раствором фукорцина на разных участках тела. Группы были однородными по возрасту и массе животных. Для воспроизведение отека использовали модель карагенанового воспаления стопы. Для этого с помощью инсулинового шприца с тонкой иголкой каждой крысе в левую заднюю лапку субплантарно вводили 0,1 мл 1 суспензии карагенанав физиологическом растворе. Объем лапы определяли с помощью водного плетизмометра ( ,Италия) непосредственно перед исследованием, а также через 1, 2, 4 и 6 часов после введения карагенана. Рассчитывали прирост объема лапки. Полученные результаты подлежали статистической обработке с помощью программы статистического анализа , , версия 2009. Рабочие растворы получали непосредственно перед введением путем смешения в стерильных условиях растворов 3 и 4 в заданных объемных соотношениях 115, 19, 14, 23, 11, 32, 41,91 и 151. Растворы вводили из расчета 10 мл/кг массы крысы в предварительно катетеризованную бедренную вену непосредственно после субплантарной инъекции карагенана. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор (10 мл/кг). Дополнительно 10 крысам вводили раствор лечебного средства -лизина эсцината 0,1 из расчета 10 мл/кг. Как свидетельствуют данные эксперимента(таблица 1), противоотечное действие наблюдали во всех группах экспериментального лечения, тем не менее, величина эффекта в разных группах существенно отличалась. Наименьший антиэксудативный эффект, который достигал порога статистической значимости лишь на 2-м часу эксперимента, отмечено при введении растворов с соотношением 91, 151 и 115. В целом зависимость эффекта от соотношения ар носила колоколообразный характер с максимумом при соотношении 14-32, что было неожиданным результатом и не следовало из имеющейся информации об эсцине. Антиэксудативный эффект,который длился до четвертого часа исследования,был отмечен в диапазоне соотношений - и есцинов в составе субстанции от 19 до 41. 3 Таблица 1 Динамика прироста объема лапки крыса при карагенановом воспалении на фоне экспериментального лечения с применением субстанций солей -лизина и суммарного эсцина с различными соотношениями Растворы, которые вводятся Прирост объема лапки, мл (среднее арифметическоестандартная погрешность) 1 час 2 часа 4 часа 6 часов 1. Контроль (0,9 ) 0,330,041 0,760,039 1,020,042 0,830,054 2.- р 0,05 по сравнению с группой 1. Пример 3. Изучение противоотечной активности фармацевтических композиций солей -лизина и суммарного эсцина с различными соотношениями эсцина и -эсцина с этанолом. Исследования проводились по методике,детально описанной в примере 2, на 40 белых крысах-самцах линии Вистар массой 120-160 г. Известна способность этанола подавлять пенообразование растворов солей эсцина. Как пример приемлемой фармацевтической композиции была взята композиция 0,1 новой соли -лизина и эсцина и 20 этанола. 20 этанол использовали в хорошо изученном лечебном средстве -лизина эсцината, 0,1 растворе для инъекций. Рабочие растворы получали непосредственно перед введением путем смешения растворов 7 и 8 в соотношении 19, 23 и 41. В результате проведенных исследований было показано, что все три композиции имеют статистически значимый антиэксудативный эффект по сравнению с контрольной группой. Наибольший в количественном отношении и самый продолжительный(6 часов) эффект был зафиксирован в группе животных, которым вводили композицию, которая содержала соли - и -эсцина в соотношении 23, что подтверждает результаты исследований, приведенных в примере 2. Таблица 2 Динамика прироста объема лапки крыса при карагенановом воспалении на фоне экспериментального лечения с применением субстанций солей -лизина и суммарного эсцина с различными соотношениями эсцина и - эсцина и композиций на их основе. Растворы, которые вводятся Прирост объема лапки, мл (среднее арифметическоестандартная погрешность) 1 час 2 часа 4 часа 6 часов 1. Контроль (0,9 ) 0,330,041 0,760,039 1,020,042 0,830,054 2. Композиция соли эсцина 0,220,045 0,550,048 0,830,045 0,720,051 19 с 20 этанолом 3. Композиция соли эсцина 0,180,035 0,470,037 0,720,044 0,650,035 23 с 20 этанолом 4. Композиция соли эсцина 0,270,035 0,530,040 0,860,042 0,760,045 41 с 20 этанолом- р 0,05 по сравнению с группой 1. Пример 4. Сравнение гемолитической активности солей -лизина и суммарного эсцина с различными соотношениями -эсцина и -эсцина. Характерной особенностью сапонинов есть гемолитическая активность. Гемолиз - еще один из основных факторов,который ограничивают применение высоких доз эсцина в клинической практике. Высокая гемолитическая активность сапонинов приводит к флебитам и появлению других нежеланных побочных реакций при 4 внутривенном введении. Принцип метода исследования гемолитической активности состоит в определении концентрации гемоглобина,высвобожденного из гемолизованных эритроцитов,после удаления из раствора целых эритроцитов. Суспензии отмытых эритроцитов человека и растворов исследованных субстанций, которые предварительно получали путем серийных разведений (таблица 3), инкубировали при температуре 36 С - 37 С в буферном физиологическом растворе (БФР) с 7,4 на протяжении часа. Далее целые эритроциты отделяли путем центрифугирования при 2700 об/мин на протяжении 10 минут. Жидкость над осадком помещали в кювету спектрофотометра с толщиной слоя 10 мм и измеряли оптическое поглощение при длине волны 523 нм. Процент гемолизованных эритроцитов рассчитывали,як соотношение оптических поглощений тестового и контрольного(полностью гемолизованного) растворов с учетом поглощения раствора, который не содержал эритроцитов. За гемолитический титр принимали величину максимального разведения рабочего раствора, в котором наблюдали существенный гемолиз. Существенным считали гемолиз больше 5 эритроцитов. Таблица 3 Получение растворов для оценки гемолитической активности Компоненты (мл) Исследованный Отмытые БФР Вода для инъекций раствор эритроциты х 32 0,0625 0,2 1,74 х 64 0,031 0,2 1,77 х 128 0,016 0,2 1,78 х 256 0,0078 0,2 1,79 х 512 0,0039 0,2 1,8 х 1024 0,002 0,2 1,8 Контроль 1 1 1 Контроль 2 0,2 1,8 Контроль 3 0,2 1,8 Примечание контроль 1 - контроль оптического поглощения раствора без эритроцитов, контроль 2 контроль спонтанного гемолиза, контроль 3 - полный гемолиз. Исследованные растворы получали, как описано в примерах 2 и 3. Дополнительно тестировали готовое лечебное средство -лизина эсцината, 0,1 раствор для инъекций, и 0,1 раствора солей лизина и суммарного эсцина с соотношением 23, который дополнительно содержал 20 пропиленгликоля. Последний получали путем смешения растворов 5 и 6 в соотношении 32(23). В исследованиях использована венозная кровь здорового добровольца, взятая после подписания формы осведомленного соглашения. С целью уменьшения ошибки каждый опыт повторяли 4 раза. Полученные результаты подлежали статистической обработке с помощью программы статистического анализа , ,версия 2009. Таблица 4 Результаты оценки гемолитической активности солей -лизина и суммарного эсцина с различными соотношениями суммы эсцина а и эсцинак сумме изоэсцина а и изоэсцинаи композиций на их основе Исследований раствор Процент гемолизованных эритроцитов (среднее арифметическоестандартная погрешность) х 32 х 64 х 128 х 256 х 512 х 1024-лизина эсцината 100 100 100 7510,6 20,52,3 Раствор 2320 ЕТ 100 100 9210,5 457,8 9,42,8 Раствор 2320 ПГ 100 100 100 729,1 16,73,6 Примечания ЕТ - этанол ПГ - пропиленгликоль спонтанный гемолиз составил 0,7. Как свидетельствуют результаты эксперимента,гемолитическая активность раствора солей -лизина и суммарного эсцина существенно не изменялась в пределах 14-91. При соотношении а(319 и 119 гемолитическая активность увеличивалась, что Гемол итичес кий титр 512 512 512 512 512 256 256 256 256 512 512 512 не противоречит известным литературным данным о большей гемолитической активности -эсцина и его солей. Прибавление этанола к раствору соли лизина и эсцина существенно не влияло на гемолитическую активность, что свидетельствует о 5 приемлемости этанола в составе фармацевтической композиции. Прибавление пропиленгликоля к раствору соли -лизина и эсцина существенно увеличило его гемолитическую активность. Гемолитическая активность лечебного средства лизина эсцината, 0,1 раствора для инъекций, была больше чем в растворе эсцина, что можно пояснить наличием пропиленгликоля в составе готового лечебного средства. Таким образом,учитывая результаты предыдущего исследования, можно сделать вывод о том, что подбор оптимального соотношения суммы эсцина а и эсцинак сумме изоэсцина а и изоэсцинаможет увеличить эффективность лечебного средства, при этом, существенно не влияя на его токсичность. Кроме того, исключение пропиленгликоля из состава лечебного средства может способствовать уменьшению частоты и тяжести побочных реакций. Пример 5. Сравнение влияния солей -лизина и суммарного эсцина на состояние венозной стенки и окружающих тканей кроля при внутривенном введении. Развитие флебита в месте инъекции есть наиболее распространенным осложнением терапии с использованиям лечебного средства -лизина эсцината, 0,1 раствора для инъекций. Известно,что как эсцин, так и дополнительные вещества в составе лечебного средства,в частности,пропиленгликоль, при внутривенном введении могут вызывать развитие флебита. Данный эксперимент проведен с целью выяснения эффекта от исключения пропиленгликоля из состава лечебного средства на его действие как местного раздражителя. Исследования проводились по модифицированной методике. (1967),С./,, 2002, 1007 Использовано 18 кролей-самцов, распределенных на 6 групп по 3 животных. После окончания 10-дневной акклиматизации 1 и 2 группе животных делали внутривенную инъекцию 0,5 мл неразбавленного лечебного средства -лизина эсцината, 0,1 раствора для инъекций. Аналогично кролям 3 и 4 групп вводили стерильный 0,1 раствор солей лизина и суммарного эсцина в соотношении 23 в физиологическом растворе натрия хлорида. Животным 5 и 6 групп вводили стерильный 0,1 раствор солей -лизина и суммарного эсцина в соотношении 23 в 20 пропиленгликоле(методика получения приведена в предыдущем исследовании). Исследуемые растворы вводили в крайнюю вену слева от уха. Одновременно в контралатеральную вену вводили 0,9 раствор натрия хлорида в количестве 0,5 мл (негативный контроль). Все растворы вводились одноразово болюсно. После инъекций за состоянием животного велось ежедневное наблюдение. Через 24 и 72 часа после инъекций путем передозирования тиопенталового наркоза проводилось выведение из исследования животных 1,3,5 и 2,4,6 группы соответственно. Части уха с зонами инъекций ампутировали. С помощью лупы проводили исследования тканей в месте инъекции. Реакцию в месте введения оценивали по специальной шкале (таблица 4). Таблица 5 Шкала оценки действие препарата как местного раздражителя при внутривенном введении Характеристика тканей на месте инъекции Видимой реакции нет Незначительная гиперемия на месте инъекции Умеренная гиперемия и/или изменение цвета вены и окружающих тканей на месте инъекции Выраженное изменение цвета вены и окружающих тканей на месте инъекции по сравнению с окружающими тканями с частичной или полной окклюзией вены Рассчитывали средний балл для всех 6 животных, которые получали данный тестовый раствор, по которому проводилась оценка результатов 0,0-0,4 - действие местного раздражения отсутствует 0,5 -1,4 - слабое действие местного раздражения 1,5-2,4 - умеренное действие местного раздражения 2,5 и больше - выраженное действие местного раздражения. Таблица 6 Результаты оценки влияния соли -лизина и суммарного эсцина на состояние венозной стенки и окружающих тканей кроля при внутривенном введении Исследованный раствор-лизина эсцината 0,1 ГЛЗ Раствор соли -лизина и эсцина 0,1 23 Раствор соли -лизина и эсцина 6 Средний балл Исследование Контроль 0,83 0 0,33 Баллы по каждому животному Исследование Контроль 24 час. - 1,1,2 72 24 час. - 0,0,0 72 час. час. - 0,1,0 Средний балл Исследование Контроль(таблица 5) было установлено, что лечебное средство -лизина эсцината, 0,1 раствор для инъекций, как и раствор суммарного эсцина в 20 пропиленгликоле, вызывал на месте инъекции умеренное раздражающее действие на венозную стенку и окружающие ткани. Неожиданно было обнаружено, что раствор соли -лизина и суммарного эсцина в физиологическом растворе местного раздражающего действия не имел. Полученные результаты позволяют допустить, что развитие флебита на месте инъекции -лизина эсцината в значительной степени обусловлено наличием в составе готового лечебного средства пропиленгликоля,а исключение последнего позволит существенно снизить частоту развития побочных реакций. Таким образом,заявленное изобретение исполняет поставленную задачу относительно получения лечебного средства, которое имеет выраженное противоотечное действие в соединении с противовоспалительным и обезболивающим Баллы по каждому животному Исследование Контроль час. - 0,1,1 действием и уменьшенной частотой проявления побочных реакций. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Фармацевтическая субстанция, которая представляет собой соль аминокислоты-лизина и эсцина, отличающаяся тем,что эсцин представляет собой смесь эсцина а, эсцина ,изоэсцинаи изоэсцина , где соотношение суммы эсцина а и эсцинак сумме изоэсцина а и изоэсцинасоставляет 2,0-9,08,0-1,0. 2. Фармацевтическая субстанция по п.1, где соотношение суммы эсцина а и эсцинак сумме изоэсцина а и изоэсцинасоставляет 4,0-9,06,01,0. 3. Фармацевтическая композиция, которая содержит фармацевтическую субстанцию по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель. 4. Фармацевтическая композиция по п.3, которая проявляет противоотечное, противо-воспалительное действие.