Способ диагностики патогенного гриба Stagonospora nodorum вызывающих септориоз злаковых культур методом ПЦР Real-time

(51) 12 1/68 (2006.01) 01 33/53 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ К ПАТЕНТУ диагностики, процент финансовых затрат и технологических ошибок. В качестве праймеров для проведения ПЦР в реальном времени, используются олигонуклеотиды 130 53 и 550 5- -3,флуоресцентный зонд 330 51-3,комплементарные не менее чем на 94 гену септориоза вызванным возбудителем высокочувствительной и специфичной тест-системой на основе полимеразной цепной реакцией позволяет точно и очень быстро(5 - 6 часов) выявлять ДНКиз пораженного растения. При этом возможно одновременное исследование большого количества проб. Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов.(72) Бейшова Индира Салтановна Коканов Сабит Кабдышевич Чужебаева Гульжаган Джамбуловна Ульянов Вадим Александрович Ковальчук Александр Михайлович Завриев Сергей Кириакович Стахеев Александр Александрович Рязанцев Дмитрий Юрьевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Костанайский государственный университет им. А. Байтурсынова Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПАТОГЕННОГО ГРИБАВЫЗЫВАЮЩИХ СЕПТОРИОЗ ЗЛАКОВЫХ КУЛЬТУР МЕТОДОМ ПЦР(57) Полезная модель относится к молекулярной биологии,в частности к фитопатологии. Последовательность олигонуклеотидов - праймеров позволяющих определять строго специфичный участок ДНК последовательности патогенного грибаметодом поимеразной цепной реакции (ПЦР), а также позволит сократить время Полезная модель относится к молекулярной биологии, в частности к фитопатологии, а именно к применению видоспецифичных праймеров и флуоресцентного зонда в опытах с использованием полимеразной цепной реакции для обнаружения патогенного гриба. Применение праймеров и флуоресцентного зонда позволяет обнаруживать патогенный грибу злаковых культур. Известны следующие способы диагностики патогенного гриба 1. Посредством техники микроскопирования,когда тем или иным способом подготовленные ткани растения исследуют при помощи визуализации под световым или иным микроскопом. Поражения растения детектируют визуально. Биологический метод. Метод применяют для выявления внешней и внутренней зараженности семян болезнями 1. , ., . 109, .6. . 523-534. Основными недостатками указанных методов является трудоемкость и знание обширных тонкостей классической таксономии. Кроме этого,использование обычного морфометрического анализа не всегда дает возможность точно идентифицировать виды,имеющие перекрывающийся диапазон признаков, что весьма характерно для представителей рода . ПЦР анализ самый современный метод детекции микробных клеток. Особенность его заключается в том, что имеется большое разнообразие праймеров и в зависимости от конкретных последовательностей очень варьирует результат исследования. 2. Известен патент США 95/04712 2161196 2. Патент 95/04712 2161196 выдан 19.04.1995 года. Авторы Новартис АГ (СН),Джеймс М. Лигон (СН), Джеймс Дж. БЕК . Данная методика позволяет обнаружить такие фитопатогенные грибы, как, ,,, ,, ,. Преимуществом разработанных нами последовательностей нуклеотидов (праймеров и флуоресцентного зонда) является специфичность,состав азотистых оснований, а также структура последовательностей подобрана таким образом, что разница температур их плавления минимальна. Преимуществом разработанных нами последовательностей нуклеотидов (праймеров и флуоресцентного зонда) является специфичность,состав азотистых оснований, а также структура последовательностей подобрана таким образом, что разница температур их плавления минимальна. Задачей полезной модели являлось разработка тест-системы для лабораторной диагностикиметодом ПЦР -. Технический результат полезной модели является разработка тест-системы для лабораторной диагностики(ПЦР -). Поставленная задача решается путем подбора пар олигонуклеотидных праймеров и зонда,специфичных для. Для подбора специфичных праймеров дляиспользовали нуклеотидные последовательностигена рибосомальной РНК различных штаммов. Последовательности были проанализированы с помощью онлайн программы(///.). Подбор праймеров и зонда проводили с использованием комплекса программ 9.0. Уровень гомологии подобранных праймеров не менее чем 94. Сущность полезной модели. Поставлена задача разработать тест-систему для лабораторной диагностикиметодом ПЦР- на основе амплификации участка гена рибосомальной РНК с помощью реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в реальном времени участкагена для увеличения количества копий ДНК патогенного гриба. Поставленная задача решается тем, что нужно составить комплекты реагентов для проведения различных этапов ПЦР-анализа, а именно для выделения грибковой ДНК, постановки ПЦР с помощью амплификатора ДТ-96 или аналогичном. При этом уровень гомологии подобранных праймеров составляет не менее 94. Патогенный гриб выявляется в результате флуоресцентного свечения и считывания прибором полученного результата. Далее информация о результатах выводится на монитор компьютера. Основным критерием отбора олигонуклеотидов специфичных патогенному грибуявлялось отсутствие гомологии с другими близкородственными патогенными грибами зерновых культур. Таким образом, длягена патогенного грибабыли подобраны пара праймеров, которые высококонсервативны и специфичны к своему типу и не имеют гомологии с другими типами патогенного гриба и с другими родственными патогенными грибами. Диагностика патогенного грибавысокочувствительной и специфичной тест-системой на основе полимеразной цепной реакцией позволяет точно и очень быстро(5-6 часов) выявлять ДНК патогенного грибаиз биоматериала. При этом возможно одновременное исследование большого количества проб. Также преимуществом данной тест-системы заключается в том, что в качестве праймеров для проведения ПЦР, используются олигонуклеотиды 130 53 и 550 53,флуоресцентный зонд 330 5- СТТТ-1-3,комплементарные не менее чем на 94 гену септориоза вызванным возбудителем. Локализация выше указанных праймеров и зонда изображена на фиг.1. Описание сущности полезной модели. Предлагаемая тест-система для лабораторной диагностики предусматривает выделение ДНК патогенного гриба, синтез ДНК, постановку ПЦР на амплификаторе ДТ-96 или аналогичном, интерпретация результатов. В состав предложенной тест-системы входят два комплекта реагентов для проведения различных этапов ПЦР-анализа. Комплект реагентов 1 для выделения ДНК состоит из следующих компонентов Раствор 1 - 2 х СТАВ буфер (хранить при комнатной температуре) СТАВ - 2 (/),1.4 М,,8.0 - 0.1 , ЭДТА - 20 мМ, Н 2(СТАВ) Раствор 2 - 5 х СТАВ буфер (хранить при комнатной температуре) СТАВ - 5 (/),ЭДТА -350 Мм, Н 2 Раствор 3 - буфер для преципитации (хранить при комнатной температуре) СТАВ - 1 (/),,8.0 - 50 мМ, ЭДТА - 10 мМ, Н 2 Раствор 4 - - буфер (хранить при комнатной температуре)- 1 М,,8.0 - 10 мМ,ЭДТА - 1 мМ, Н 2. Хранить при 4 С. Так же вместо предложенного комплекта реагентов для выделения ДНК можно использовать коммерческие наборы для выделения ДНК согласно инструкции производителя либо другие известные способы выделения ДНК. Например, набор для выделения ДНК из растительной ткани Проба-НК. Комплект реагентов 2 для проведения ПЦР(амплификации участка ДНК) состоит из следующих компонентов 18 мкл 1,25 х буфера для ПЦР 0,24 мкл 25 м 0,125 мкл каждого праймера (100 мкМ) 0,14 мкл зонда (50 мкМ) 10 мкл раствора -полимеразы 5 мкл ДНК. Срок хранения тест-системы 12 месяцев. Полезная модель иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Выбор последовательности праймеров. Учитывая большую вариабельность генома патогенного гриба, при его обнаружении необходимо использовать праймеры,соответствующие наиболее консервативным участкам гриба генома. Основой для поиска мест отжига праймеров стало сопоставление нуклеотидных последовательностейгенов всех близкородственных грибов, представленных в международной базе данных. При выборе мест посадки праймеров учитывались следующие требования специфичность праймеров для всех последовательностей патогенного гриба, отсутствие мест отжига праймеров на последовательности грибов других видов. Эта работа выполнялась с помощью программ 9.0, . В качестве дополнительных критериев,определяющих пригодность праймеров, учитывались следующие отсутствие дуплексов праймеров и отжига их друг на друга, отсутствие мест ложного отжига на матрицы геномов различных штаммов патогенного гриба, а также родственных патогенных грибов. Этим критериям удовлетворяют отобранные специфические праймеры на патогенный гриб. Специфические праймеры и флуоресцентный зонд на патогенный гриб 130 - 5- -3 550 - 5-3 330 - 51-3. Пример 2. Выделение ДНК из образцов. 1. Ткань растереть в ступке с жидким азотом до светло-зелной (а не темно-зелной) пудры 2. Подготовить прогретую до 65 С пробирку с 2 х СТАВ буфера (из расчта 25 2 х СТАВ буфера на 2 - 5 ткани) 3. Перенести пудру шпателем в пробирку, очень хорошо и быстро перемешать 4. Инкубировать при 65 С минимум 20 мин.(лучше 1 ч., но можно и больше 2-3 ч.) 5. Охладить до комнатной температуры, добавить равный объм ХлороформаИзоамилового спирта(241), перемешивать 20 мин при комнатной температуре 6. Центрифугировать при 5000 при комнатной температуре, 10 мин. 7. Снять водную фазу, добавить к ней 0.2 объема 5 х СТАВ буфера 8. Перемешать, инкубировать при 65 С, 10 мин. 9. Добавить равный объм , перемешивать в течении 10 мин. При комнатной температуре 10. Центрифугировать при 5000 при комнатной температуре, 10 мин. 11. Если раствор мутный или большая интерфаза - повторить экстракцию(пункты 9 и 10) 12. Добавить равный объм буфера для преципитации (можно и 2 - 3 объма), перемешать и оставить на 1 час (или на ночь) при комнатной температуре 13. Центрифугировать при 5000-8000 при комнатной температуре, 20 мин. (если ДНК не выпадает,добавить больше буфера для преципитации, оставить на комнатной температуре на 1 час, отцентрифугировать) 14. Растворить осадок в 1 - 2- (иногда необходим нагрев до 65 С) 15. Добавить 2 объема ЕН (абс.), 1-2 часа при -20 С или 30 мин. при -70 С 16. Центрифугировать при 8000 при 4 С,10 мин. 17. К осадку добавить 200 дистиллированной Н 2 О и 100 7.5 М 4 ( 7.5) 20 мин., 0 С 18. Центрифугировать при 13000 при 4 С,10 мин. Постановку ПЦР проводили с образцами ДНК патогенного гриба. Для постановки ПЦР использовали смесь специфических праймеров (обратный и прямой) и зонда на 130550330 реакционная смесь,состоящая из следующих компонентов, указанных в таблице 1. Фермент добавляют в последнюю очередь. Таблица 1 Реактивы для проведения ПЦР Реактив Буфер для ПЦР 1,25 х(25 мМ) Праймер(100 мкМ) Праймер(100 мкМ) Зонд (50 мкМ) ФерментДНК полимераза Смесь перемешивают и раскапывают по 30 мкл в пробирки, затем в них вносят отдельным наконечником с фильтром по 5 мкл ДНК соответствующих анализируемых или контрольных образцов (ПК и ОКО). Пробы вносят в амплификатор со следующим температурным режимом Пример 5. Детекция продуктов амплификации. Детекция результатов осуществляется визуально с помощью монитора компьютера и программного обеспечения, прилагаемого к амплификатору. Положительными считают пробы, отмеченные знаком . Отрицательными считают пробы, отмеченные знаком -. Для определения специфичности ПЦР использовали патогенные грибыи. В качестве отрицательного контроля при определении специфичности ПЦР применили деионизированную воду. Результаты ПЦР с праймерами к гену 1-2 на ДНК, выделенной из охарактеризованных образцов мицелия .представлены на таблице 2. Как видно из таблицы, в пробах 1-6 содержится ДНК.- ПЦР продукт не нарабатывается, в пробах 7-14 где содержится ДНК .нарабатывается ПЦР продукт. Для оценки эффективности, чувствительности реакции и присутствия потенциальных ингибиторов 4 в реакционной смеси использовали стандартную методику. Для этих целей проводили ПЦР-РВ последовательных десятикратных разведений специфической геномной ДНК. Каждая концентрация (в диапазоне от 101 до 106 пг ДНК на реакцию) была проанализирована в четырх повторностях. На фиг.2 приведен стандартный график зависимости значенияот количества копий специфической ДНК на реакцию для праймеров .- 130- и 550-. Чувствительность тест-систем составила порядка 10 пг специфической ДНК на реакцию, что составляет около 200 копий с учтом размера генома грибов родапорядка около 36 млн. п.о. Эффективность проведения ПЦР определяли экспериментально путм последовательных разведений образца анализируемой ДНК. Каждое разведение было проанализировано в нескольких повторностях. Для каждого образца определялии строили график линейной зависимости в координатах СДНК/. График описывается уравнением линейной функции -. При этом коэффициентс отрицательным знаком показывает количество циклов, за которое происходит увеличение флуоресцентного сигнала на порядок, а 1/ - порядок изменения количества ДНК за 1 цикл ПЦР. Поскольку эффективность представляет собой изменение количества ДНК в одном цикле, то вычислить е можно, возведя 10 в степень 1/. Эффективность реакции составляла в экспериментах 96, что является весьма высокими значениям эффективности для систем ПЦР-диагностики. Разработанная тест-система для лабораторной диагностики патогенного грибана основе ПЦР - является специфичной и высокочувствительной. ФОРМУЛА ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ Способ диагностики патогенного грибавызывающих септориоз злаковых культур методом ПЦР -,предусматривающий выделение ДНК, реакцию амплификации, анализ реакционной смеси с помощью амлификатора ДТ-96 или аналогичного,отличающийся тем, что в качестве праймеров и зонда для проведения -, используют олигонуклеотиды следующего состава 130 - 5- -3 550 - 5-3 330 - 51-3.