Набор синтетических олигонуклеотидов для генотипирования линий и сортов злаковых культур методом IRAP-ПЦР

(51) 12 19/30 (2006.01) 12 1/68 (2006.01) 07 21/04 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ конкретного генотипа злаковых культур посредством совокупности операций выделение ДНК отдельно для каждого генотипа из 3-5 дневных проростков с использованием стандартных методов,амплификация ДНК каждого генотипа отдельно с каждым олигонуклеотидом из представленного набора, разделение продуктов амплификации на фракции методом электрофореза в агарозном геле,выявление полиморфных фрагментов путем регистрации длин амплификатов в соответствии с используемым праймером. Технической задачей изобретения являлась разработка набора синтетических олигонуклеотидов для генотипирования линий и сортов злаковых культур с помощью -ПЦР. При решении технической задачи был проведен поиск последовательностей ретротранспозонов для конструирования ПЦР праймеров, проведен дизайн и синтез праймеров для проведения генотипирования сортов и линий злаковых культур методом -анализа, оптимизированы протокола экстракции геномной ДНК сортов и линий злаковых культур,отработаны оптимальные условия амплификации ДНК сортов и линий злаковых культур пшеницы с информативнымипраймерами, электрофоретического разделения продуктов амплификации и регистрации их длины в соответствии с используемым праймером. Данный способ может быть использован в селекции и семеноводстве злаковых культур для установления генетической оригинальности сортов и линий.(72) Календарь Руслан Николаевич Хапилина Оксана Николаевна Тагиманова Дамеля Сеитовна Альжанова Алия Женисовна Райзер Олеся Борисовна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ЛИНИЙ И СОРТОВ ЗЛАКОВЫХ КУЛЬТУР МЕТОДОМ -ПЦР(57) Изобретение относится к молекулярной биологии и представляет собой новый набор синтетических олигонуклеотидов для генотипирования сортов и линий злаковых культур с использованием -метода полимеразной цепной реакции. Изобретение может быть использовано в селекции и семеноводстве яровой мягкой пшеницы для осуществления контроля чистоты семенного материала сортов и линий злаковых культур. Технический результат, который может быть достигнут с использованием данного набора синтетических олигонуклеотидов - выявление множества полиморфных ДНКпоследовательностей,специфичных для Изобретение относится к молекулярной биологии и представляет собой новый набор синтетических олигонуклеотидов для идентификации сортов и линий злаковых культур с использованием метода полимеразной цепной реакции. Изобретение может быть использовано в селекции и семеноводстве пшеницы для осуществления контроля чистоты семенного материала сортов и линий злаковых культур. Одним из важных аспектов генетики и практической селекции растений является детальная характеристика улучшаемого материала. Для решения этой задачи внедряются новые технологии,которые базируются на анализе полиморфизма ДНК. Созданные в результате селекции сорта растений сочетают уникальные комбинации аллелей генов, обеспечивающих адаптацию к условиям жизни и необходимый уровень развития ценных технологических признаков. Особенности набора аллелей генов и,следовательно,последовательностей нуклеотидов ДНК по сути представляют генетический паспорт сорта. Разработка методики высокоинформативного и производительного метода молекулярногенетической идентификации и паспортизации сортов, гибридов и линий мягкой пшеницы является следующим необходимым шагом для развития селекции и семеноводства в Казахстане. Молекулярные маркерные технологии играют важную роль в биологии растений, в том числе ДНК-фингерпринтинг, генетическое маркирование,исследование филогенетических связей в молекулярной селекции. Молекулярные маркеры должны обладать определенными свойствами и отвечать определенным требованиям высокий уровень полиморфизма равномерное распределение в геноме по хромосомам селективно нейтральное поведение легкая оценка параметров маркера возможность автоматизации оценки параметров маркера высокая воспроизводимость оценки параметров маркера. В последнее время в селекционных программах стали довольно часто использоваться ДНК маркеры,характеризующиеся высокой частотой встречаемости в геноме, которые могут быть детектированы с использованием современных универсальных, а значит широко востребованных и постоянно развивающихся методах анализа. Это стало залогом бурного развития направлений генетики и селекции, связанных с использованием ДНК-маркеров на основе ПЦР, таким как технологии фингерпринта на основе ПЦР к последовательностям повторов,таким как,ретротранспозоны - мобильные генетические элементы, которые составляют основную часть генома эукариот. Эти мобильные элементы,теоретически, могут внедряться в новые участки генома растений по принципу ретротранспозиции копирование и вставки, через промежуточную стадию обратной транскрипции РНК ретротранспозона. В сравнении с другими методами, маркерные системы, основанные на мобильных элементах,2 могут идентифицировать существенные изменения генома. Изучение полиморфизма ДНК с использованием нового типа молекулярногенетических маркеров, основанных на изучении фрагментов ДНК, фланкированных участком фланга ретротранспозона и его инвертированным повтором,либо участком микросателлитного локуса ( и),представляет интерес в плане генотипирования растений и животных (и человека).) ПЦР метод амплификации участка геномной ДНК между близкорасположенными последовательностями ретротранспозонов. Продукт ПЦР-амплификации геномной ДНК является стабильным генетическим-маркером. Полиморфизм в данном случае обусловлен либо мутацией в участке связывания праймера, либо уникальным биологическим процессом ретротранспозицией, в результате встраивания ретротранспозона в новый участок геномной ДНК без потери первоначального участка. Аналог изобретения. Нами не найдено аналогичного набора синтетических олигонуклеотидов для идентификации сортов и линий регенерантов с использованиемметода. Из аналогичных изобретений можно отметить патент на набор синтетических олигонуклеотидов для определения ДНК геномодифицированной кукурузы линий Т 25 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (Турганбаева А.К.,Какимжанова А.А, Рашиденова Ж.А., Старцев В.А.,Раманкулов Е.М. Набор синтетических олигонуклеотидов для определения ДНК геномодифицированной кукурузы линий Т 25 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени //Республика Казахстан, Инновационный патент 26273, кл. С 12 Р 19/34, 12 1/68, РГП на ПХВ Национальный центр биотехнологии КН МОН РК з. 07.11.2011, публ. 15.10.2012). Данный патент предполагает использование набора синтетических олигонуклеотидов, нацеленных на выявление 1 целевого локуса - трансгенной вставки в ДНК кукурузы. Недостатками этого набора является возможность использования только на одном виде растений, принадлежащих к роду злаковых (Роасеае), а также детекция только линий кукурузы,подвергнутых генетической модификации,при этом не происходит идентификация генетической оригинальности линий кукурузы. Отличие предлагаемого нами набора синтетических олигонуклеотидов от аналога заключается в использовании новых информативных праймеров, нацеленных напоследовательности ретротранспозонов злаковых культур, в том числе и кукурузы. Возможность идентификации не одного,а множества полиморфных локусов, высокая информативность и стабильность результатов делают данный набор наиболее предпочтительным для идентификации как межвидовых, так и внутривидовых отличий растений, а также паспортизации сортов, линий и гибридов злаковых культур. Преимущество данного набора состоит в том,что впервые предлагаются синтетические олигонуклеотиды для амплификации участков геномной ДНК между близкорасположенными последовательностями ретротранспозонов с целью детекции генетической оригинальности сортов и линий злаковых культур ПЦР методом . Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с аналогом позволяет сделать вывод, что заявляемый набор синтетических олигонуклеотидов отличается от известного условиями осуществления действий, а именно используемыми веществами - праймерами. Задача изобретения - разработка набора синтетических олигонуклеотидов для генотипирования линий и сортов злаковых культур с помощью -ПЦР. Технический результат, который может быть достигнут с использованием данного набора синтетических олигонуклеотидов - выявление полиморфных ДНК-последовательностей,специфичных для конкретного генотипа злаковых культур посредством совокупности операций выделение ДНК отдельно для каждого генотипа из 3-5 дневных проростков с использованием стандартных методов, амплификация ДНК каждого генотипа отдельно с каждым олигонуклеотидом из представленного набора, разделение продуктов амплификации на фракции методом электрофореза в агарозном геле,выявление полиморфных фрагментов путем регистрации длин амплификатов в соответствии с используемым праймером. Достижения технического результата позволят установить генетическую оригинальность сортов и линий злаковых культур, идентифицировать сорта,что повысит эффективность селекции и закрепит авторские права селекционеров. Пример 1. Выделение ДНК отдельно для каждого генотипа с использованием стандартных методов. Выделение геномной ДНК проводили из 3-5 дневных проростков каждого генотипа в отдельности с использованием СТАВ метода. Гомогенизация растительных проб проводилась в СТАВ-буфере (2 СТАВ, 2 М , 0,05 М ,0.2 М -,6.0-7.0), инкубация при 65 С в течение 1-3 ч. Далее проводилось экстракция ДНК в эмульсионной смеси с хлороформа и осаждением водной фазы с помощью изопропанола и центрифугированием при 12000 об/мин и последующей промывкой осадка ДНК в 70 этаноле. Экстрагированная ДНК наблюдалась в виде осадка на дне микропробирок, который растворяли в ТЕ-буфере. Пример 2. Амплификация ДНК каждого генотипа в отдельности с каждым праймером. Поиск последовательностей ретротранспозонов для получения ПЦР праймеров, идентифицирующих генетическую оригинальность сортов мягкой пшеницы, проведен с использованием электронных баз данных(///),(//////). Последующий анализ последовательностей ретротранспозонов пшеницы в базе данных известных повторов всех организмовс помощью программыпозволил выделить последовательности ретротранспозонов для дальнейшего конструирования праймеров к консервативным участкам. Для конструирования универсальных праймеровпроанализировано 10 последовательностей, относящихся к семейству ретротранспозонов -. С использованием программы(//./.) выявлены стабильные участки, пригодные для дальнейшей разработкипраймеров, которые представляют собой синтетические олигонуклеотиды. Нуклеотидные последовательности используемых праймеров представлены в таблице 1. Таблица 1 АААТСС ССАС ТАСТТА АСТСССТТА состава праймеров варьировалась от 55 С до 60 С. Для проведения амплификации использовали реакционную смесь для ПЦР следующего состава ДНК 25 нг, ПЦР буфер (2 мМ О 4 10 мМ С 10 мМ (4)2 О 4 20 мМ -,8,8), 0,5-1 мкМ праймера, Источник( ). Режим амплификации был следующим предварительная денатурация при 95 С в течение 3 минут, затем 30-32 циклов 95 С - 20 с, 55-65 С 30 с, 72 С - 1 минута последняя элонгации при 72 С Пример 3. Разделение продуктов амплификации на фракции методом электрофореза в агарозном геле. Полученные продукты амплификации(ампликоны) визуализировали в 1.2-1.5 агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Размеры молекул, анализируемых образцов ДНК, определяли путем сопоставления их электрофоретической подвижности в геле с подвижностью маркеров фрагмент ДНК известной молекулярной массы. В качестве маркера молекулярных масс использовали(10010,000(0332). Определение длин фрагментов проводилось с использованием программыв системе гельдокументации -2(фиг.1). Каждый генотип характеризуется характерным сочетанием полиморфных амплифицированных фрагментов различной длины. В спектрах ампликонов исследуемых форм имелись блоки размером от 200 до 3000 п.о., с различной плотностью распределенные между генотипами. Общее количество ампликонов варьирует в зависимости от используемых образцов растений,при этом характер их распределения, а также интенсивность насыщения спектра амплификации является индивидуальным для каждого генотипа. определение сортовой принадлежности или генетической оригинальности злаковых культур. Суммарное количество ампликонов длятехнологии может достигать 100 и даже более,уровень детектируемого полиморфизма не ниже 20 для близкородственных сортов и до 60-70 для генетически отдаленных сортов и линий. Предлагаемый набор праймеров к последовательностям ретротранспозонов является довольно информативным с позиции выявления генетической оригинальности линий, кроме того результаты амплификации отличаются воспроизводимостью и простотой обработки. Преимуществом данного подхода является то, что при использовании меньшего количества праймеров(в сравнении с другими методами анализа),возможно получить достаточное количество дискрипторов, обладающих высоким уровнем полиморфизма. Для генотипирования и идентификации сортов и линий злаковых культур -методом достаточно не более 5 высокоэффективныхпраймеров, для дифференциации и генетической паспортизации. Суммарное количество полиморфных ампликонов позволяет проводить идентификацию и паспортизацию любого нового сорта или линии. Вследствие того, что последовательности используемыхпраймеров были разработаны на консервативных участках ретротранспозонов родственных видов, относящихся к семейству Роасеае(злаковые). Поэтому,применение предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов не ограничивается только пшеницей или близкородственными видами пшеничной трибы, но позволяет использовать этот набор для других злаковых видов (фиг.2). М - маркер молекулярной массы(100-10,000) (1 ) 1-27 - линии пшеницы Фиг.1 - Электрофорез продуктовамплификации ДНК различных сортов пшеницы спраймером 679 Пример 4. Выявление полиморфных фрагментов путем регистрации длин амплификатов в соответствии с используемым праймером. Путем сравнения длин полиморфных ДНК фрагментов в определяемых образцах проводят При этом детектируется различное количество полиморфных фрагментов, в зависимости от вида злаковых культур, что позволит использовать данный метод для генотипирования ржи, ячменя,овса. Высокая степень информативности предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов обусловлена повсеместным распространением последовательностей ретротранспозонов по всем хромосомам, включая теломерные и центромерные участки хромосом, 4 кодирующие участки и гетерохроматин. Так как разные участки хромосом могут иметь разную скорость изменчивости и различную степень участия в мейозе, поэтому, -технология для идентификации и паспортизации селекционного материала, наиболее подходит для быстрого и дешевого анализа, охватывающего различные участки хромосом,с различным уровнем(гены,повторы,структурный хроматин и т.д.). Данные ПЦР - анализа используются для разработки детальных формул, позволяющих оценить генетическую структуру линий регенерантов. Данные формулы могут быть использованы для разработки молекулярногенетических паспортов линий и сортов пшеницы,пример в таблице 3. Таблица 3 Молекулярно-генетические формулы генотипов яровой мягкой пшеницы Молекулярно-генетическая формула содержит полную информацию об идентификационных маркерах, их размерах и код праймера. При проведении идентификации с использованием 11 молекулярно-генетических маркеров было исследовано 57 сортов и линий регенерантов мягкой пшеницы. Сочетание полиморфных фрагментов ДНК не совпадают ни у одного из генотипов. Предлагаемый набор синтетических олигонуклеотидов отличается информативностью и высокой разрешающей способностью, а также относительной простотой выполнения и высокой воспроизводимостью.(Роасеае), отличающийся тем, что может быть использован для генотипирования сортов и линий растений,путем выявления множества специфичных и полиморфных для конкретного генотипа локусов, следующего состава