Способ интенсификации процесса биосинтеза н – бутилового спирта, ацетона и этанола

(51) 12 7/16 (2006.01) 12 7/26 (2006.01) 12 7/06 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) 12 1/145 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ ИНТЕНСИФИКАЦИИ ПРОЦЕССА БИОСИНТЕЗА Н-БУТИЛОВОГО СПИРТА, АЦЕТОНА И ЭТАНОЛА(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для синтеза н-бутилового спирта, ацетона и этанола, а также производства растворителей. В предлагаемом техническом решении в качестве сырья используют ферментационную среду следующего состава, вот сухих веществ ферментативно-гидролизованная целлюлоза из отходов древесины - 40-70, пшеничные отруби - 2040, картофельный крахмал - 5-20 в суммарной концентрации 70-100 г/л, углекислый кальций - 1,02,0 г/л, вода - остальное,среды 7,0-7,2, процесс ведут в течение 38-40 ч. при объме посевного материала 4-6 от объема сбраживаемой среды, а в качестве активатора метаболизма бактерий родаи способа повысить их резистентность к продуктам метаболизма (растворителям) в состав среды дополнительно вводят госсиполовую смолу в количестве 2-2,5. Изобретение позволяет повысить выход нбутилового спирта и ацетона и расширить сырьевую базу для их получения.(72) Надиров Казим Садыкович Приходько Наталья Александровна Есимова Анар Маденовна Надирова Жанна Казимовна Нарымбаева Зауре Каркиновна Саденова Мирам Канторекызы Булабаева Эльмира Жумабековна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения ЮжноКазахстанский государственный университет им. М.Ауэзова Министерства образования и науки Республики Казахстан Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для синтеза н-бутилового спирта, ацетона и этанола, а также производства растворителей. Н-бутиловый спирт,ацетон и этанол применяются во многих отраслях промышленности,например, в качестве сырья для синтеза ряда органических продуктов, в виде жидкого топлива, а также в качестве растворителей в лакокрасочной промышленности, в производстве синтетической резины,шелка,при экстрагировании фармацевтических препаратов и других отраслях. Н-бутанол, ацетон и этанол могут быть получены и химическим способом, однако качество получаемых на заводах синтетического каучука продуктов невысокое из-за значительного содержания в них непредельных соединений. В связи с этим такие спирты не находят применения в лакокрасочной и фармацевтической промышленности,которые используют высококачественный н-бутиловый спирт,полученный биотехнологическим способом. Существующие промышленные производства микробиологического синтеза н-бутилового спирта,ацетона и этанола основаны на использовании ацетоно-бутиловых бактерий, относящихся к роду. Бактериипри сбраживании различных углеводов синтезируют одновременно три целевых продукта н-бутиловый спирт, ацетон и этанол, получившие общее название органические растворители,процентное соотношение которых колеблется в пределах 603010. Это соотношение не является строго постоянным и может значительно варьировать в сторону увеличения выхода того или иного продукта брожения (Промышленный регламент на производство растворителей ацетона, бутанола и этанола способом брожения. ПР 64-35-89,г. Ефремов, 1989). За рубежом в последние годы, в связи с энергетическим кризисом, появляется большой интерес к получению растворителей методом брожения (США, Канада, Германия, Япония,Франция и др.). По имеющимся сведениям из технической литературы н-бутанол и ацетон во многих странах получают синтетическим путем, но бродильные производства также становятся выгодными,благодаря использованию возобновляемых источников энергии и побочных продуктов (газов брожения). Энергия бутанола на 10 больше бензина, бутанол выделяет больше чистой энергии на рабочий цикл двигателя, чем метанол или этанол. Бутанол безопаснее в использовании, поскольку в шесть раз меньше испаряется, чем этанол и в 13,5 раз менее летуч, чем бензин. Сейчас бутанол используется в качестве оксигената в штатах Аризона, Калифорния и др. Бутанол - гораздо менее агрессивное вещество, чем этанол, поэтому может транспортироваться по существующим топливным трубопроводам, тогда как этанол должен транспортироваться железнодорожным или водным транспортом. Бутанол может, но не обязательно должен,2 смешиваться с традиционными топливами. Бутанол может полностью заменять бензин, тогда как этанол может использоваться только как добавка к бензину с максимальным содержанием в смеси не более 85 и только после существенных переделок двигателя. При горении бутанол не производит окислов серы или азота, что дает существенную дополнительную выгоду с точки зрения экологии. Бутанол может использоваться в топливных элементах, как сырь для производства водорода. Поэтому интенсификация биотехнологического метода получения н-бутанола - достаточно актуальная задача. Основными направлениями исследований за рубежом являются конструирование новых штаммов ацетоно-бутиловых бактерий методами генетической инженерии и разработка технологических приемов по производству и выделению конечных целевых продуктов,который за 66 часов брожения на мучных средах накапливает в культуральной жидкости 13,5-15,5 г/дм 3 органических растворителей, в том числе н-бутилового спирта 9,0-10,0 г/дм 3, ацетона 3,5-4,0 г/дм 3 и этанола 1,0-1,5 г/дм 3. Имеются сообщения о штаммах мутантах,накапливающих на мучных средах за 66 часов брожения 9,0-10,0 г/дм 3 н-бутанола, 4,3-4,9 г/дм 3 ацетона и 1,3-1,9 г/дм 3 этанола (Любимова И.К. Великая М.А. и др. Биосинтез растворителей мутантами С. , устойчивыми к 2-дезокси-Дглюкозе. Биотехнология, - 1993,8, с.10-12). Известен способ повышения выхода растворителей при культивировании бактерий С. на мучных средах за счет предварительного разжижения крахмала рециркулируемой бражкой,содержащей активные амилолитические ферменты. При этом выход растворителей достигает 19 г/л, а время брожения сокращается на 9 ч (А.с. СССР 1604852. Способ сбраживания крахмалсодержащей среды для получения ацетона,бутанола и этанола. - 1990 г.). Описаны штаммы мутанты С.(АТСС 39058), продуцирующие на искусственной питательной среде с глюкозой 12-17 г/л растворителей, в том числе 10-12 г/л бутанола и 4,05,0 г/л ацетона. Культивирование одного из мутантов на среде с израильским артишоком позволило получить бутанола до 15 г/л (Патент США 456843, 1986). Однако такие результаты получены в лабораторных экспериментах с использованием искусственных сред, экзотических инулиновых субстратов (бугорки земляной груши, георгина,корни цикория и др.) и гидролизатов отходов зерновых производств, которые не нашли промышленного использования. Наиболее близким к настоящему изобретению является штаммВКМ В 2512,депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН под номером ВКМ В-2512 (Патент РФ 2393213,ШТАММ БАКТЕРИЙ ПРОДУЦЕНТ НБУТИЛОВОГО СПИРТА, АЦЕТОНА И ЭТАНОЛА,Опубл. 27.06.2010). ШтаммВКМ В-2512 не является генетически модифицированным штаммом. На выходе общее содержание растворителей в культуральной жидкости составляет 30,0 г/дм 3, в том числе 23,0 г/дм 3 н-бутанола, 4,0 г/дм 3 ацетона и 3,0 г/дм 3 этанола. Конверсия углеводов крахмала в образовавшиеся растворители составляет 55,5. Общим недостатком перечисленных штаммовпродуцентов и способов является недостаточно высокий уровень накопления целевых продуктов(кроме прототипа) в связи с низкой резистентностью используемых бактерий к продуктам метаболизма, а также присутствие в значительных количествах третьего продукта - этанола (в том числе и для прототипа), что усложняет технологический процесс выделения конечных продуктов. Кроме того, все эти штаммы требуют добавления в среды пищевого сырья муки или отрубей, а также большого количества минеральных добавок. Резистентность к продуктам метаболизма является одной из наиболее исследуемых проблем, которые связаны с микробиологическим производством бутанола. Известно, что бутанол делает невозможным потребление глюкозы, поэтому не происходит образования энергии в клетке и наблюдается внутриклеточное падение активности АТФ-азы. Допускается, что изменения, связанные с процессом споруляции, влияют на толерантность бактерий к бутанолу. Однако установленным фактом в исследованиях процесса ацетоно-бутилового брожения является также то, что на выход растворителей и долевое соотношение целевых продуктов в значительной степени влияет состав сырья, используемого для брожения /7/ и введение различных активаторов, что позволяет продолжить поиски субстратов и условий культивирования с целью интенсификации процесса. Задача изобретения состоит в разработке экономически и технологически эффективного способа,позволяющего производить интенсификацию процесса биосинтеза,обеспечивающую повышение биоконверсии исходного сырья в растворители, общего выхода растворителей,повышение толерантности к бутанолу, расширенный диапазон использования дешевых, нетрадиционных субстратов и изменение процентного соотношения продуктов от 603010 в сторону увеличения выхода н-бутанола. Указанный технический результат достигается тем, что в качестве продуцента н-бутилового спирта,ацетона и этанола используется штаммВКМ В-2512, процесс брожения проводят на ферментационной среде, содержащей ферментативно-гидролизованную целлюлозу из отходов древесины 40-70,пшеничные отруби 20-30, картофельный крахмал 5-15 в суммарной концентрации 70-100 г/л,углекислый кальций - 1,0-2,0 г/л, вода - остальное,процесс ведут в присутствии в качестве добавки госсиполовой смолы в количестве 2-2,5. Бактерии рода способны продуцировать бутанол в процессе ацетонобутилового брожения,при наличии соответствующего субстрата и оптимальных условий для самого процесса брожения. Исследования метаболизма этих бактерий с целью создания штаммов с высокой производительностью выхода бутанола были начаты с начала возникновения генной инженерии и продолжаются до этого времени учеными многих стран мира. Известно, что штаммВКМ В-2512 относится к микроорганизмам, не патогенным для человека/6/,согласно классификации микроорганизмов, приведенной в Санитарных правилах СП 1.2.731-99. Работа со штаммомВКМ В-2512 не требует специальных мер предосторожности. Он сбраживает крахмал,глюкозу,целлобиозу,фруктозу, галактозу, мальтозу, манозу, сахарозу,глицерин и пируват. Растет при температуре от 15 до 45 С на средах с 4,0-8,0 /6/, что позволяет расширить спектр применяемых субстратов (от традиционно используемых сред, содержащих сырь пищевого назначения муку, крахмал, мелассу и т.д. до сред, содержащих отходы) с целью снижения себестоимости целевых продуктов, т.к. расходы на сырь в данном процессе составляют до 70 от общей себестоимости. Проводятся работы относительно расширения диапазона потребления субстратов бактериями рода. В частности, в качестве потенциального субстрата исследуется целлюлоза. Для потребления бактериями целлюлозы необходимое наличие ферментов, которые отвечают за ее расщепление. Существует несколько сиквенорованных микроорганизмов, которые содержат полный функциональный целюлазный комплекс, к тому же известны целюлолитические клостридии), которые продуцируют ацетат,лактат, и этанол как первичные метаболиты. Ряд работ показывает, что бактерии родамогут усваивать целлюлозу без каких-либо генетических модификаций, но несмотря на то, что указанные бактерии содержат полный комплекс генов целюлазных ферментов, они не способны к полному расщеплению целлюлозы. Причиной этого является или наличие гена, который препятствует функционированию целлюлаз или существенная мутация в структуре фермента, или неспособность к перенесению и активации целюлосомы в правильном клеточном месте /8/. Практических результатов в этом направлении пока не достигнуто,поэтому нами в качестве основного дешевого сырья предлагается использовать не нативную целлюлозу в составе древесных отходов, а предварительно 3 частично ферментативно-гидролизованную целлюлозу, в которой содержится значительное количество целлобиозы, которую выбранный штамм хорошо утилизирует. Целлобиоза - углевод из группы дисахаридов, состоящий из двух глюкозных остатков, соединнных глюкозидной связью,основная структурная единица целлюлозы. Получают е при частичном гидролизе целлюлозы. В свободном виде целлобиоза содержится в соке некоторых деревьев. Целлобиоза образуется при ферментативном гидролизе целлюлозы бактериями,обитающими в желудочно-кишечном тракте жвачных животных. Выбор условий проведения процесса сбраживания и развития бактерий является существенным фактором, определяющим выход растворителей. Эффективным активатором их метаболизма для образования бутанола оказалась госсиполовая смола, которая содержит госсипол. Госсиполовая смола - это отход производства хлопкового масла из семян хлопчатника (гудрон дистилляции жирных кислот),однородная вязкотекучая масса от темно-коричневого до черного цвета. В госсиполовой смоле содержится от 52 до 64 сырых жирных кислот и их производных,остальная часть - продукты конденсации и полимеризации госсипола и его превращений,образующиеся при извлечении масла, главным образом, в процессе дистилляции кислот из соапстоков. В госсиполовой смоле обнаружено 12 азотсодержащих соединений, 36-40 продуктов превращения госсипола. Наряду со свободными,также присутствуют связанные жирные кислоты в составе ди- и триглицеридов. Нами в процессе работы использована госсиполовая смола состава 98,29 органических веществ 1,71 неорганических веществ 100 эфирорастворимых веществ кислотное число равно 68,5 мг КОН йодное число - 97 число омыления - 200 мг КОН/г эфирное число - 135 мг КОН гидроксильное число 91 ЖК, высвобождаемые при омылении - 64 38 нежирных веществ 0,2165 фосфора (в пересчете на Р 2 О 5) 8,78 кальция. Госсиполовая смола также содержит некоторое количество изомеров токоферолов, которые при омылении локализуются в неомыляемой части. Применение госсиполовой смолы в качестве целенаправленного активатора метаболизма бактерий родаи способа повысить их резистентность к продуктам метаболизма(растворителям) не описано, нами установлено впервые. Таким образом, заявляемое техническое решение соответствует критерию новизна. Нами установлено, что введение госсиполовой смолы в сбраживаемую среду позволяет значительно ускорить процессы биосинтеза и степень биоконверсии (фиг.1), а также повысить выход суммарного продукта и резистентность штамма к продуктам метаболизма (фиг.2) и изменить соотношение н-бутиловый спиртацетонэтанол от 603010 (традиционный, по литературным данным) до 83134 (фиг.3). Заявляемый способ реализуется следующим образом. Посевным материалом засевают ферментационную среду следующего состава, вот сухих веществ ферментативно-гидролизованная целлюлоза из отходов древесины (40-70),пшеничные отруби (20-40), картофельный крахмал(5-20), госсиполовая смола (2-2,5) в суммарной концентрации 70-100 г/л, углекислый кальций - 1,02,0 г/л, водопроводная вода - остальное,среды 7,0-7,2. Приготовленную ферментационную среду в количестве 7 л помещают в ферментер для анаэробного сбраживания объемом 9 л и стерилизуют при 0,75 атм в течение 25 мин, затем сразу охлаждают до температуры 37 С. После этого туда вносят (с соблюдением правил асептики) вегетативный посевной материал штамма ВКМ В-2512 в количестве 4-6 от объема сбраживаемой среды и процесс ведут при температуре 37 С в течение 38-40 ч до окончания процесса брожения. В культуральной жидкости определяют содержание нбутанола, этанола и ацетона методом газовой хроматографии и величину несброженных сахаров,кроме того, в процессе брожения фиксируют(газоанализатором) количество образующихся газов брожения. На выходе общее содержание растворителей в культуральной жидкости составляет 31-33 г/л, в том числе н-бутилового спирта - 82-83), ацетона 13-14, этанола - 4,биоконверсия составляет 61-62,1, в зависимости от условий. Таким образом, в оптимальных условиях (пример 1) степень биоконверсии возрастает на 6,6, н-бутанола образуется в 1,2 раза больше, а этанола - в 2,1 раза меньше, чем в методе прототипа. Соотношение н-бутиловый спирт ацетон этанол изменяется от 771310 до 83134(таблица 1). При этом стоимость питательной среды снижается в 3-4 раза, себестоимость продукции - в 2-2,5 раза. Примеры 1-3 подтверждают границы изменения заявляемых параметров, а пример 4 показывает, что несоблюдение заявляемых условий не позволяет достичь указанный технический результат. Пример 1. Посевным материалом засевают ферментационную среду следующего состава, вот сухих веществ ферментативно- гидролизованная целлюлоза из отходов древесины - 60, пшеничные отруби - 30, картофельный крахмал - 7,5,госсиполовая смола - 2,5, всего в суммарной концентрации 90 г/л, углекислый кальций - 1,5 г/л,водопроводная вода - остальное,среды 7,1. Приготовленную ферментационную среду в количестве 7 л помещают в ферментер для анаэробного сбраживания объемом 9 л и стерилизуют при 0,75 атм в течение 25 мин, затем сразу охлаждают до температуры 37 С. После этого туда вносят (с соблюдением правил асептики) вегетативный посевной материал штамма ВКМ В-2512 в количестве 5 от объема сбраживаемой среды и процесс ведут при температуре 37 С в течение 40 ч до окончания процесса брожения. На выходе общее содержание растворителей в культуральной жидкости составляет 33 г/л, в том числе нбутилового спирта - 83, ацетона 13, этанола 4, биоконверсия составляет 62,1. Таким образом,степень биоконверсии возрастает на 6,6, нбутанола образуется в 1,2 раза больше, а этанола - в 2,1 раза меньше, чем в методе прототипа. Соотношение н-бутиловый спирт ацетон этанол изменяется от 771310 до 83134. При этом стоимость питательной среды снижается в 3-4 раза,себестоимость продукции - в 2-2,5 раза. Пример 2. Посевным материалом засевают ферментационную среду следующего состава, вот сухих веществ ферментативно-гидролизованная целлюлоза из отходов древесины - 40, пшеничные отруби - 40, картофельный крахмал - 17,5,госсиполовая смола - 2,5 в суммарной концентрации 70 г/л, углекислый кальций - 1,0 г/л, водопроводная вода - остальное,среды 7,0. Приготовленную ферментационную среду в количестве 7 л помещают в ферментер для анаэробного сбраживания объемом 9 л и стерилизуют при 0,75 атм в течение 25 мин,затем сразу охлаждают до температуры 37 С. После этого туда вносят (с соблюдением правил асептики) вегетативный посевной материал штамма ВКМ В-2512 в количестве 4 от объема сбраживаемой среды и процесс ведут при температуре 37 С в течение 38 ч до окончания процесса брожения. На выходе общее содержание растворителей в культуральной жидкости составляет 32 г/л, в том числе нбутилового спирта - 82, ацетона - 14, этанола 4, биоконверсия составляет 61. Таким образом,степень биоконверсии возрастает на 5,5, нбутанола образуется в 1,2 раза больше, а этанола - в 2,1 раза меньше, чем в методе прототипа. Соотношение н-бутиловый спиртацетонэтанол изменяется от 771310 до 82144. При этом стоимость питательной среды снижается в 3 раза,себестоимость продукции - в 2 раза. Пример 3. Посевным материалом засевают ферментационную среду следующего состава, вот сухих веществ ферментативно-гидролизованная целлюлоза из отходов древесины (67,5), пшеничные отруби ферментационную среду в количестве 7 л помещают в ферментер для анаэробного сбраживания объемом 9 л и стерилизуют при 0,75 атм в течение 25 мин,затем сразу охлаждают до температуры 37 С. После этого туда вносят (с соблюдением правил асептики) вегетативный посевной материал штамма ВКМ В-2512 в количестве 6 от объема сбраживаемой среды и процесс ведут при температуре 37 С в течение 40 ч до окончания процесса брожения. На выходе общее содержание растворителей в культуральной жидкости составляет 31 г/л, в том числе нбутилового спирта - 83, ацетона - 13, этанола 4, биоконверсия составляет 62. Таким образом,степень биоконверсии возрастает на 6,5, нбутанола образуется в 1,2 раза больше, а этанола - в 2,1 раза меньше, чем в методе прототипа. Соотношение н-бутиловый спиртацетонэтанол изменяется от 771310 до 83134. При этом стоимость питательной среды снижается в 4 раза,себестоимость продукции - в 2,5 раза. Пример 4. Посевным материалом засевают ферментационную среду следующего состава, вот сухих веществ ферментативно-гидролизованная целлюлоза из отходов древесины - 70, пшеничные отруби - 19,5, картофельный крахмал - 7,госсиполовая смола - 3,5 в суммарной концентрации 110 г/л, углекислый кальций - 3 г/л, водопроводная вода - остальное,среды 7,5. Приготовленную ферментационную среду в количестве 7 л помещают в ферментер для анаэробного сбраживания объемом 9 л и стерилизуют при 0,75 атм в течение 25 мин,затем сразу охлаждают до температуры 37 С. После этого туда вносят (с соблюдением правил асептики) вегетативный посевной материал штамма ВКМ В-2512 в количестве 3 от объема сбраживаемой среды и процесс ведут при температуре 37 С в течение 38 ч до окончания процесса брожения. На выходе общее содержание растворителей в культуральной жидкости составляет 20 г/л, в том числе нбутилового спирта - 66, ацетона - 22, этанола 12, биоконверсия составляет 55. То есть несоблюдение заявляемых условий не позволяет достичь указанный технический результат. Результаты биосинтеза н-бутанола, ацетона и этанола по заявленному способу и прототипу представлены в таблице 1. Таблица 1.(3) Прототип 55,5 23,0 4,0 3,0 Заявляемый способ (без госсиполовой смолы) 51,8 18,0 6,1 4,2 Заявляемый способ (с госсиполовой смолой) 62,1 27,1 4,3 1,4 в оптимальных условиях, пример 1 Изобретение позволяет повысить выход нбутилового спирта и ацетона и расширить сырьевую базу для их получения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ интенсификации процесса биосинтеза нбутилового спирта, ацетона и этанола, включающий 5 выращивание штамма-2512 продуцента н-бутилового спирта,ацетона и этанола в глубинной культуре в анаэробных условиях при температуре 37 С с последующим выделением целевого продукта и в качестве питательной среды,используют ферментационную среду следующего состава, вот сухих веществ ферментативно-гидролизованная целлюлоза из отходов древесины - 40-70,пшеничные отруби - 20-40, картофельный крахмал- 5-20 в суммарной концентрации 70-100 г/л,углекислый кальций - 1,0-2,0 г/л, вода - остальное,рН среды 7,0-7,2, отличающийся тем, что процесс ведут в течение 38-40 часов при объеме посевного материала 4-6 от объема сбраживаемой среды, а в качестве активатора метаболизма бактерий родаи повышения их резистентности к продуктам метаболизма (растворителям) в состав среды дополнительно вводят госсиполовую смолу в количестве 2-2,5.