Рекомбинантный штамм Escherichia coli ArcticExpess(DE3)RP/pPFh, продуцирующий термостабильную ДНК полимеразу археи Pyrococcus furiosus Pfu-pol

(51) 12 15/09 (2006.01) 12 1/21 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ дезоксирибонуклеиновые кислоты фермента в полимеразной цепной реакции. Путем клонирования гена - изв составе плазмидного вектораи трансформации данной генетической конструкцией клеток(3)/ создан штамм-продуцент рекомбинантнойДНК полимеразы. Штамм-продуцент(3)/ осуществляет внутриклеточное накопление рекомбинантного белка -. Выделение и очисткаДНК полимеразы осуществляется ферментативным лизисом клеточной стенки клеток рекомбинантного штамма с последующей ступенчатой очисткой целевого белка методами метало-аффинной и аффинной хроматографии за счет наличия в белке метало- и ДНК-связывающих доменов. Полученный и очищенный фермент обладает ферментативной активностью в отношении дезоксирибонуклеиновых кислот полимеразной активностью в направлении 53 и экзонуклеазной активностью в направлении 35. Активность полимеразных свойств белка представленного в буфере хранения определена методом полимеразной цепной реакции и составила 5 единиц на один микролитр (ед/мкл).(72) Мусахметов Арман Сартамбаевич Кирибаева Асель Калиаскаровна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович Хасенов Бекболат Бауржанович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(3)/,ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ТЕРМОСТАБИЛЬНУЮ ДНК ПОЛИМЕРАЗУ АРХЕИ(57) Изобретение относится к области генетической инженерии молекулярной биотехнологии. Термостабильная ДНК полимераза используется в качестве полимеризующего Изобретение относится к области генетической инженерии,молекулярной биотехнологии,созданный штамм-продуцент позволяет получить фермент - применяемый в полимеразной цепной реакции, для научных исследований в области молекулярной биологии и диагностикумах. Получена термостабильная ДНК полимераза археи- с помощью рекомбинантного штамма(3)/. Штамм-продуцент получен на основе штамма(3) путем трансформации оригинальным плазмидным вектором,несущим полноразмерный ген -. Изобретение позволяет получить рекомбинантный термостабильный белокДНК полимеразу до 75000 единиц, что соответствует 10 мг очищенного белка из 1 литра среды, обладающую полимеразной активностью в направлении 53 и экзонуклеазной(корректирующей) активностью в направлении 35. В отличие от известной и часто используемой Та-полимеразы из бактерии,допускающей ошибки при полимеризации, полимераза из штамма археидемонстрирует более высокую точность копирования ДНК за счет наличия 3-5 экзонуклеазной активности фермента. Штаммвпервые был выделен и охарактеризован Жерардом Фиола ( ) и Карлом Стетте ( ) в 1986 году из гипертермальных донных отложений на острове Вулканов Тирренском море. Полимеразаиз данного штамма была выделена и описана авторами в 1996 году ( . ,,., Патент США 5545552). -полимераза не единственный термостабильный фермент,обладающий корректирующей 35 экзонуклеазной активностью. Из родственногоштамма 1 была выделена полимеразаДНК полимераза( Н.,М.., 2001). Изучение ее активности и кристаллической структуры показало родственность эукариотическим полимеразам семейства В. В литературе описан ряд других полимераз со схожими функциями ( .. 1996), например -полимераза выделенная из, однако -полимераза наиболее известна и востребована в качестве точной полимеразы, которая используется и самостоятельно и в составе смеси с Таполимеразой. ИспользованиеиДНК полимераз в смеси предпочтительно тем, что обе полимеразы дополняют друг друга-полимераза обеспечивает высокую скорость полимеризации, а(3) заключается в использовании бактерии с пониженным уровнем протеолитического расщепления рекомбинантного белка и загрязнения выделяемого белка наиболее 2 активными протеазами. Более того,содержание шаперонов психрофильной бактерииСр 10 и Ср 60 позволяет добиться оптимальной укладки такого крупного белка как - с молекулярной массой 92,3 кДа,что в целом способствует высокому выходу рекомбинантного белка. Использование плазмидного векторапозволяет получать полимеразу с высокой ферментативной активностью до 75000 единиц (10 мг из 1 литра среды),обладающую полимеразной активностью в направлении 53 и экзонуклеазной активностью в направлении 35. Задачей изобретения является создание рекомбинантного штамма(3)/,содержащего и экспрессирующего генДНК полимеразы археи. Полноразмерный генДНК полимеразы археи методами генетической инженерии встраивали в плазмидный вектор под контроль индуцируемого промотора РНКполимеразы бактериофага Т 7. В составе данного вектора открытая рамка считывания для белкасодержит дополнительный олигопептид на 20 аминокислотных остатка пришитый генноинженерным способом к -концу целевого белка,содержащий мотив,имеющий высокую связывающую активность к ионам двухвалентных металлов, в том числе к ионам никеля 2. Сам штамм-продуцент(3)/ получают методом электропорации компетентных клеток(3) созданным плазмидным вектором . Трансформанты отбирают на среде с канамицином, изменение генотипа определяют методом ПЦР на тотальной ДНК с помощью праймеров специфичных к гену -. Для культивирования штамма(3)/ использовали среду Луриа-Бертани , содержащую в расчете на 1 литр бактериологический триптон (10 г), бактодрожжевой экстракт (5 г) и(5 г), стерилизация при 121 С - 30 минут. Культивировали при температуре 37 С и встряхивании 120-180 оборотов в минуту в присутствии канамицина в концентрации 50 мкг/мл до оптической плотности 6000,6. После добавляли активатор индукции промотора 1 ас-оперона изопропил 1 тиогалактопиранозид в концентрации 0,05 мМ и инкубировали 16 часов при 37 С и встряхивании 120 об/мин. Культуру проверяли на способность продуцироватьДНК полимеразу. Условия хранения на криосохранении при -80 С в 50 среде и 50 глицерине, концентрация клеток 109 колониеобразующих единиц в 1 мл среды,лиофильно высушенные образцы - при температуре 4 С, -20 С -40 С и -80 С в течение 10 лет,криоконсервированные образцы - при температуре хранения -80 С, в течение 10 лет. Полученный штамм-продуцент(3)/ характеризуется следующими признаками Среда, температура, возраст, условия роста среда, 37 С, 120 , 16 ч. Морфологические признаки палочки 1,1-6 мкм, грамотрицательные,спор и цисты не образует, кислотонеустойчивы,подвижны за счет перитрихиальлых жгутиков. Культуральные признаки при росте на агаризованной средеколонии округлые, с ровными краями, консистенция мягкая, с блеском. Диаметр колоний 1 мм, цвет поверхности - светлокоричневый. Рост в жидкой среде сопровождается появлением резкого запаха, помутнением среды. Физиолого-биохимические признаки температурный оптимум для роста клеток 30 С 37 С, оптимум 7,2-7,4, тип размножения бинарное деление, агрегаты клеток - одиночные или парами. Устойчивость к антибиотикам клетки проявляют устойчивость к гентамицину и канамицину,обусловленную наличием в хромосомной ДНК гена , а в плазмиде гена а. Принадлежность к трофической группе хемогетеротроф. Тип катаболизма дыхание,брожение. Отношение к кислороду факультативный анаэроб. Размер генома, наличие и характеристика плазмид Генотип -(3)10 60. Содержит плазмиду(7698 п.н.). Дифференцирующие компоненты клеточной стенки индол, ацетилметилкарбинол (ацетоин),лимонная кислота, лактоза. Дифференцирующие антигены О- и К-антигены. Полученный штамм-продуцент(3)/ депонировали в Депозитарии ТОО Казахский научноисследовательский институт перерабатывающей и пищевой промышленности,регистрационный номер, присвоенный коллекцией -489. 2. Выделение и хроматографическая очистка целевого белка -. Для наработки белка замороженную культуру рекомбинантного штамма вносили в бульон ЛуриаБертани, содержащий антибиотик канамицин(50 мкг/мл) и инкубировали при интенсивном встряхивании при температуре 37 С до достижения середины логарифмической фазы роста. После чего для индукции промотора вносили изопропил 1-тиогалактопиранозид. После 16 часовой инкубации клетки собирали, лизировали методом ферментативного лизиса путем инкубации образца с мурамидазой яичного лизоцима в концентрации 2 мг/мл в течение 30 минут при комнатной температуре (22 С - 24 С) с последующим ультразвуковым соникированием в импульсном режиме в течение 30 минут. При лизисе был добавлен фенилметилсульфонил флуорид ингибирования сериновых протеаз. Полученный лизат инкубировали в водяной бане при температуре 75 С в течение 1 часа для денатурации термочувствительных белков Далее, лизат центрифугировали на высокоскоростной центрифугес использованием ротора 20 при следующих условиях 18200 об/мин (40000),4 С в течение 1 часа. Эффективным оказалась двухступенчатая очистка белка методом металлоаффинной хроматографии на ионах никеля с использованием имидазола в качестве элюирующего агента и аффинная хроматография на гепарине. Очищенный фермент суспендировали в буфере состоящем из 20 мМ - ( 8,2), 1 мМ ,0,1 мМ , 100 мМ С, 0,1 (/)Р-40,0,1 (/)20 и 50 глицерина по объему и хранили при температуре -20 С. Молекулярная масса полученного рекомбинантного аналога-полимеразы соответствует 92,3 кДа. Полная аминокислотная последовательность насчитывает 795 аминокислотных остатков Выход целевого белка - составляет 10 мг из 1 литра среды, что составляет 75000 единиц активности. Рекомбинантный белок - обладает ферментативной активностью в отношении дезоксирибонуклеиновых кислот полимеразной активностью в направлении 53 и экзонуклеазной активностью в направлении 35. Тестирование проводилось электрофорезом в полиакриламидном геле содержащем додецил сульфат натрия по протоколу описанному Лэммли ( 4 // . - 1970. - . 27. - . 680-685). Концентрация белка определялась колориметрическим методом по Бредфорду с использованием белка бычего сывороточного альбумина в качестве стандарта ( М.М.3- . . . 1976 72 .248254). Активность полимеразных свойств белкаопределялась методом полимеразной цепной реакции в буфере 20 мМ - ( 8,8), 10 мМ(4)24, 10 мМ , 0,1 (/) -Х 100,0,1 мг/мл , 2 мМ 4. Технический результат получен рекомбинантный штамм ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Рекомбинантный штамм(3)/, депонированный в Депозитарии ТОО Казахский научноисследовательский институт пищевой и перерабатывающей промышленности под регистрационным номером В-489 , продуцирующий термостабильную ДНК полимеразу археи-.