Рекомбинантная плазмида pcdna3.1(+)-bap-hp1α, кодирующая гетерохроматиновый белок человека hp1α и обеспечивающая его экспрессию в клетках нек293т

(51) 12 15/09 (2006.01) 12 15/11 (2006.01) 12 1/68 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Сконструирована рекомбинантная плазмида 3.1 (фиг.1) размером 7472 п.н.,содержащая следующие конструктивные элементы фрагмент ДНК векторной плазмиды 3.1 размером 5374 п.н., на основе промотра(цитомегаловирусный промотор),с генами устойчивости к ампициллину и неомицинуфрагмент, кодирующий ген СВХ 5 (5) или гетерохроматинового белкачеловека ( ,.//, 1992,.131,2,.345-352, //. . . ., 2000, .10,2, .204-210), конъюгированного с пептидом акцептором биотина ВАР . В плазмидную конструкцию также включены последовательности, бицистронного транскрипционного элемента,позволяющего экспрессировать два белка из одного транскрипта и селекционного маркера 2 (альфа цепи рецептора интерлейкина 2) между сайтамииразмером 1436 п.н. ( .,//.., 1988, .170, .341-348). В структуре плазмиды имеется также консенсусная последовательность Козакперед ВАР,важная для инициации трансляции ( М. //.., 1991, .115, .4, Р.887-903) в эукариотических клетках. Сконструированная плазмида 3.1.ВАР.НР 1 обеспечивает высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка ВАР.НР 1, достаточного для работ, связанных с количественной оценкой его экспрессии в эукариотических клетках и изучения белокбелковых взаимодействий.(72) Кулыясов Арман ТабыловичОгрызько Василий Викторович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА 3.11,КОДИРУЮЩАЯ ГЕТЕРОХРОМАТИНОВЫЙ БЕЛОК ЧЕЛОВЕКА 1 И ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ЕГО ЭКСПРЕССИЮ В КЛЕТКАХ НЕК 293 Т(57) Изобретение относится к генной инженерии,биохимии, биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для создания метода ранней диагностики рака. На сегодня ни одно заболевание не связано с мутацией генов кодирующих гены , ,. Однако имеются сообщения, что изменения в уровне экспрессии этих генов связаны с различными видами рака. Поэтому разработка методов,позволяющих количественно оценивать экспрессию и белок-белковые взаимодействия 1, являются актуальными. Технической задачей изобретения является создание рекомбинантной плазмиды,обеспечивающей возможность точной количественной оценки экспрессии и белокбелковых взаимодействий гетерохроматинового белка НР 1. Изобретение относится к генной инженерии,биохимии, биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для создания метода ранней диагностики рака. Эукариотические геномы упакованы в два типа хроматина эухроматин и гетерохроматин,отличающиеся сиквенсом, модификацией гистонов и ассоциированными с хромосомными белками( ,//. . . ., 2002,12, .178-187). Богатый генами эухроматин упакован нуклеосомами содержащими гистон Н 3,метилированный при лизине 4 (Н 34 е),эпигенетический маркер характерный для промотеров генов несущих РНК-полимеразу . В противоположность этому, обедненный генами гетерохроматин упакован нуклеосомами содержащими гистон Н 3 метилированный при лизине 9 (Н 34 е). Модификации гистоновых хвостов изменяют упаковку хроматина и белокбелковые взаимодействия регулирующие процессы на хроматине. Идентифицированы несколько белков, которые специфически связываются с модификациями гистоновых хвостов. Одним из них является гетерохроматиновый белок(НР 1),эволюционно-консервативный негистоновый хромосомный белок, который в основном присутствует в гетерохроматине, а также в специфических участках эухроматина ( В., // ., 2008, .9, Р.267-272). Белки НР 1 образуют семейство на основании наличия в их структуре двух консервативных доменов хромодоменаи хромошэдоу домена, разделенных гибкой петлей ( .,// ., 2006, .7,7, .228.1-228.8). Первый представитель этого семейства был выделен из плодовой мухии называется( .,// .,2005, ., .96-108). Геном мыши кодирует три вида, 1 ис функциями аналогичными белкам из( Р.В.,//., 1991, .19, .789-794). Аналогичные три вида белков НР 1 закодированы в геноме человека( Е.,//.., 2000, 90,.279-284). В клетках млекопитающих уменьшение уровня НР 1 приводит к дефектам сегрегации хромосом. Нокдаун гена как , так ив клеткахотменяет локализацию кинетохорного белка 12, связывающейся с 1, что приводит к сегрегации хромосомы ( С.,//..,2004,.6,.1135-1141). Все это свидетельствует о том, что НР 1 необходим для стабильности центромер в различных организмах,чтобы укрепить хроматиновую структуру. На сегодня ни одно заболевание не связано с мутацией генов кодирующих гены , ,. Однако, имеются сообщения, что изменения в уровне экспрессии этих генов связаны с различными видами рака. Исследования по изучению профиля экспрессии генов обнаружили уменьшение уровня мРНКв раке щитовидной железы ( ,.//..,2003, 9, .68-75). Аналогично, уменьшение уровня мРНК НР 1 замечено в случае опухоли головного 2 мозга ( ,.//, 2002, .436-442).является прогностическим маркером на наличие рака в организме человека (2012/0046190 , 23 февраля 2012), изменение экспрессии которого в опухолевых клетках, в сравнении со здоровыми клетками позволяет достоверно диагностировать рак молочной железы и опухоль мозга ( .К.,.//, 2008, .647,1-2, .13-20), рак мочевого пузыря, яичников и поджелудочной железы (.,.//., 2009,.,3, .178-191). Поэтому разработка методов, позволяющих количественно оценивать экспрессию и белок-белковые взаимодействия НР 1,являются актуальными. Сконструирована рекомбинантная плазмида 3.1(фиг.1) размером 7472 п.н.,содержащая следующие конструктивные элементы фрагмент ДНК векторной плазмиды 3.1 размером 5374 п.н., на основе промотра(цитомегаловирусный промотор),с генами устойчивости к ампициллину и неомицинуфрагмент, кодирующий ген СВХ 5 (5) или гетерохроматинового белкачеловека ( ,.//, 1992,.131,2,.345-352, //. . . ., 2000, .10,2, .204-210), конъюгированного с пептидом акцептором биотина ВАР . В плазмидную конструкцию также включены последовательности, бицистронного транскрипционного элемента,позволяющего экспрессировать два белка из одного транскрипта и селекционного маркера 2 (альфа цепи рецептора интерлейкина 2) между сайтамииразмером 1436 п.н. ( .,//.., 1988, .170, .341-348). В структуре плазмиды имеется также консенсусная последовательность Козакперед ВАР,важная для инициации трансляции ( М.//..,1991,.115,.4,Р.887-903) в эукариотических клетках. Наиболее близким к заявляемой плазмиде прототипом является рекомбинантный вектор экспрессии на основе плазмиды с промотором от вируса мышиной лейкемии (,или ). Данный вектор разработан для методики выделения и очистки мультимерных белковых комплексов из клеток млекопитающих ( .,.//. 2003, .370, .430-444). Недостатком данного прототипа является то, что в этой плазмиде используется слабый промотор, в то время как в заявляемой плазмиде имеется более сильный промотор , что важно,когда необходима высокая экспрессия интересующего белка в случае транзиентной трансфекции клеток. Другим недостатком прототипа является наличие домена ВАР,кодирующего пептид, к которому биотин-лигаза достаточно легко присоединяет биотин (2009/0275081 , 30 января 2009). В заявленной плазмиде этот домен ВАР оптимизирован и соответствено обладает более широким диапазоном линейности биотинилирования ( М.,// , 2013, .23, .331-340). Технической задачей изобретения является создание рекомбинантной плазмиды,обеспечивающей возможность точной количественной оценки экспрессии и белокбелковых взаимодействий гетерохроматинового белка НР 1. Поставленная техническая задача достигается новой сконструированной плазмидой 3.1, размером 7472 п.н.,обеспечивающей необходимый уровень экспрессии рекомбинантного белка. в эукариотических клетках. Способ конструирования плазмиды заключается в синтезе полноразмерного гена, состоящего из домена ВАР и гена СВХ 5 или гетерохроматинового белкав одной рамке трансляции, между которыми нет стоп-кодонов. Сначала при помощи ПЦР получают ген СВХ 5, фланкированный сайтами узнавания для эндонуклеаз рестрикциии . Для этого моделируют и синтезируют праймеры с учетом наличия сайтови , позволяющий клонировать этот ген в вектор, созданный на основе 3.1, содержащий домен ВАР (.,//., 2011, .10, .4416-4427). Заявляемая плазмида состоит из следующих элементовДНК векторной плазмиды 3.1 размером 5374 п.н.- фрагмент, кодирующий ген СВХ 5(5) или гетерохроматинового белкачеловекаКонсенсусной последовательности Козакперед ВАР Домена ВАРПоследовательности,и селекционного маркера 2 между сайтамииразмером 1436 п.н. Физическая карта плазмиды 3.1 с указанием генетических маркеров приведена на фиг.1, где 1 нуклеотидная последовательность гена СВХ 5) - домен пептида акцептора биотина, последовательность бицистронного транскрипционного элемента,позволяющего экспрессировать два белка из одного транскрипта,2 (-2 ) - селекционный маркер, - селекционный маркер гена устойчивости к ампициллину. Отличием предлагаемой плазмиды от прототипа является наличие в ее составе гена, кодирующего синтез гетерохроматинового белка человека(прогностического маркера на наличие рака), более сильного промотораи оптимизированного домела ВАР, позволяющего проводить более точные количественные измерения экспрессии и взаимодействии белка . Сущность изобретения поясняется следующими примерами конкретного выполнения изобретения. Пример 1. Конструирование плазмиды 3.1 Для получения гена СВХ 5 был проведен дизайн олигонуклетидов-праймеров, содержащих сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикциии ,что позволило провести клонирование по этим сайтам в векторную плазмиду 3.1.ВАР. Олигонуклеотиды-праймеры Для клонирования гена СВХ 5 использовали плазмиду ЕР 20020291316,30 мая 2002),которую использовали в качестве матрицы для ПЦРамплификации. Полученный ампликон гена СВХ 5 клонировали в вектор 3.1 Условия ПЦР денатурация 94 С - 15 сек, отжиг 56 С - 30 сек, элонгация 72 С - 2 мин, количество циклов - 20. Протокол реакции синтеза гена. Таблица 1 Состав смеси 1 для синтеза СВХ 5 Состав смеси 2 для синтеза СВХ 5 Компоненты смеси 2 5 х буфер ПЦР 4 полимераза 2 Смешали смеси 1 и 2 и загрузили в ПЦР амплификатор (таблица 1 и 2). Часть продуктов ПЦР-реакции (10 мкл или 1/5 часть от объема) для визуализации подвергали электрофорезу в 0.8 агарозном геле, затем окрашивали с помощью бромистого этидия. Оставшуюся часть ПЦРпродуктов (40 мкл) помещали в пробирки с фильтрующими элементами из набора для очистки продуктов ПЦР фирмы(номер по каталогу Р 36461, . А, 03/05) и добавляли 300 мкл воды. Центрифугировали в центрифуге при 1000 , в течение 15 мин, для удаления солей и праймеров. Далее в фильтрующий элемент, содержащий амплифицированную ДНК, добавляли 20 мкл воды,переворачивали, вставляли в новую пробирку из набора и центрифугировали 2 мин при 1000 . Векторную ДНК 3.12 (1 мкг),а также продукт ПЦР-амплификации гена СВХ 5 подвергали гидролизу рестриктазамии(20 е.а. в 20 мкл реакционной смеси) в соответствующих буферных растворах при 37 С в течение 2 часов. Гидролизат разделяли электрофорезом в 0.8 агарозном геле, затем окрашивали с помощью бромистого этидия. Визуализированные в УФ-свете фрагменты вырезали, помещали кусочки геля в пробирки, из набора для выделения ДНК из агарозного геля фирмы(номер по каталогу 050) и центрифугировали при 5000 , 10 мин. Цитирование полученных на предыдущей стадии вектора и фрагмента ДНК осуществляли с помощью лигазы фага Т 4 в течение ночи при 4 С. После трансформации компетентных клеток Е.штамма 5, и отбора клонов, несущих рекомбинантные плазмиды со встроенным геном,получали плазмиду 3.1 Пример 2. Экспрессия рекомбинантных белков. в клетках НЕК 293 Т Экспрессию рекомбинантных белков из полученных плазмид 3.1.ВАР.НР 1,осуществляли в клетках НЕК 293 Т с применением кальцийфосфатного метода ( ,//, 1973, .52,2, . 456-467). Для оценки взаимодействия белковв ядрах клеток использовали также плазмиды, кодирующие белок Тар 54, белок из семейства АТР-зависимых ДНК-геликаз ( Т., //, 2000, .02,4, .463-473) для дополнительного внутреннего контроля. Известно, что белок Тар 54 (- 2) существует в виде олигомеров, состоящих из нескольких копий с близкородственным Тар 54 а( Т.,//. . ., 2007,366, .179 192). Гетерохроматиновый белоктакже образует олигомеры благодаря наличию в структуре хромошэдоу домена. Однако, белки Тар 54 ине взаимодействуют друг с другом, что в случае гетерологичной котрансфекции ВАР. и.54 должно приводить к уровню биотинилирования сравнимого с фоновым, в то время как гомологичная котрансфекция . и. должна приводить к высокому уровню биотинилирования. Во второй плазмиде- это биотин-лигаза, фермент присоединяющий биотин к пептиду ВАР. Идея эксперимента состояла в одновременной контрансфекции 3 плазмидами (2 плазмиды . и ВАР.Тар 54, и третьей либо 54). За 1 день до трансфекции посеяли 200,000 клеток НЕК 293 Т в каждую лунку 6 луночной планшеты в 2 мл среды , содержащей 10 фетальной телячьей сыворотки и 1 смеси антибиотиков пенициллина и стрептамицина. На следующий день за 1 час до трансфекции поменяли среду на свежую 2 мл . Для проведения трансфекции в расчете на 1 лунку приготовили по две пробирки на 1.5 мл,промаркированные 0 А, 0 В (1 А, 1 В или 2 А, 2 В). В одну пробирку (раствор А) загрузили 220 мкл воды,31 мкл 2 М раствора хлорида кальция и рассчитанное согласно таблице 3 внизу количество плазмидных ДНК. Во вторую пробирку (раствор В) загрузили 250 мкл буферного раствора 2 х(Состав буферного раствора 2 х (200 )2 г, С 0.15 г, Глюкоза 0.4 г,3.2 г, 24 0.0426 г,должно составить 5.9, довелидо 7.0 добавлением небольшими порциями 1 н р-ра ,отфильтровали через стерильный фильтр фирмыи хранили при 4 С). Затем медленно по каплям добавляли раствор А к раствору В,оставляли на 15 минут и затем добавляли полученную смесь к клеткам НЕК 293 Т. На следующий день поменяли среду на новую. Через 40 часов поменяли среду на ,приготовленную добавлением 10 мкл раствора биотина (1 мг/мл) и 100 мкл 50 мМ( 7.35) к 2 мл среды (мечение биотином составляло 8 часов). Клетки собирали через 48 часов, удалили среду, затем добавили 1 мл раствора ,ресуспендировали и перенесли в пробирку на 1.5 мл. Затем пробирки центрифугировали при 4 С, 700 , 5 минут, удаляли супернатант и добавляли к клеткам по 100 мкл раствора буфера, 0.5 Х-100), пипетировали несколько раз и центрифугировали при 4000 , 5 минут. Таблица 3 Расчет количеств плазмид для трансфекции Использованная плазмида В результате на данном этапе метода были получены ядра клеток НЕК 293 Т, которые можно было заморозить до -20 С или сразу добавить 80 мкл буферабез тритона, подвергнуть соникированию (для разрушения геномной ДНК и уменьшения вязкости) и добавить 40 мкл загрузочного буфера 3 Х (Состав на 10 мл 2,4 мл 1 М Трис, рН 6.8, 0.8 г , 4 мл глицерина, 0.01 бромфенолового синего, 1 мл бета-меркаптоэтанола и 2.8 мл воды). Пробирки встряхнули, нагрели при 98 С (5 минут) и открутили на миницентрифуге на максимальной скорости. Анализ лизатов ядер с помощью иммуноблоттинга осуществляли согласно методике из сборника ( ,.,, 1999, 282). На фиг.2 приведены результаты иммуноблоттинга образцов, полученных из ядер клеток НЕК 293 Т. В левой части рисунка мембрана показывает общий уровень экспрессии белков . и ВАР.Тар 54, поскольку мембрана обработана антителами на полигистидиновый фрагмент, присутствующий в пептиде ВАР. Согласно интенсивности сигналов в образцах 1 и 2 экспрессируется примерно одинаковое количество белков(аналогично в образцах 1 и 2 наблюдается также одинаковое количество белка ВАР.Тар 54). В правой части рисунка приведена мембрана,обработанная стрептавидином, конъюгированным пероксидазой . На этой мембране наблюдается явное усиление сигнала,обусловленное взаимодействием гомологичных белков .и. (ВАР.Тар 54 и .54), выделено белым треугольником на рисунке и жирным шрифтом внизу. Таким образом,приведенные данные свидетельствуют о том, что сконструированная плазмида 3.1 обеспечивает высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка ВАР.НР 1, достаточного для работ,связанных с количественной оценкой его экспрессии в эукариотических клетках и изучения белок-белковых взаимодействий. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Рекомбинантная плазмида 3.1-1, кодирующая рекомбинантный белок 1 (гетерохроматинового белка человека),имеющая размер 7472 п.н., и содержащая следующие конструктивные элементыДНК векторной плазмиды 3.1 размером 5374 п.н.- фрагмент, кодирующий ген СВХ 5(5) или гетерохроматинового белка человека 1 Консенсусной последовательности Козакперед ВАРДомена ВАР Последовательности ЕМС,и селекционного маркера 2 между сайтамииразмером 1436 п.н.( -) цитомегаловирусный промотор- селекционный маркер гена устойчивости к ампициллину- селекционный маркер гена устойчивости к неомицину.