Рекомбинантная плазмида pcdna3.1(+)-bap-kap1, кодирующая белок транскрипционного кофактора человека кар1 и обеспечивающая его экспрессию в клетках нек293т

(51) 12 15/09 (2006.01) 12 15/11 (2006.01) 12 1/68 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Сконструирована рекомбинантная плазмида 3.11 (фиг.1) размером 7430 п.н.,содержащая следующие конструктивные элементы фрагмент ДНК векторной плазмиды 3.1 размером 5374 п.н., на основе промотра(цитомегаловирусный промотор),с генами устойчивости к ампициллину и неомицинуфрагмент, кодирующий участок гена АР 1,содержащий 1-связывающий или домен или его мутантную версию с доменом , которая не связывается с гетерохроматиновым белком НР 1 ( .//, 2011, .31, . 9,.1833-1847), конъюгированного с пептидом акцептором биотина ВАР . В плазмидную конструкцию также включены последовательности, бицистронного транскрипционного элемента,позволяющего экспрессировать два белка из одного транскрипта и селекционного маркера 2 (альфа цепи рецептора интерлейкина 2) между сайтамииразмером 1436 п.н. ( .,//.., 1988, .170, .341-348). В структуре плазмиды имеется также консенсусная последовательность Козакперед ВАР,важная для инициации трансляции ( М.//.., 1991, .115, .4, Р.887-903) в эукариотических клетках. Сконструированная плазмида 3.1 обеспечивает высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка ВАР.ар 1, достаточного для работ, связанных с количественной оценкой его экспрессии в эукариотических клетках и изучения белокбелковых взаимодействий.(72) Кулыясов Арман ТабыловичОгрызько Василий Викторович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА 3.11,КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК ТРАНСКРИПЦИОННОГО КОФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА КАР 1 И ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ЕГО ЭКСПРЕССИЮ В КЛЕТКАХ НЕК 293 Т(57) Изобретение относится к генной инженерии,биохимии, биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для создания метода ранней диагностики рака. Регуляция белканарушена во многих видах опухоли, например, в случае рака желудка,пациенты с высоким уровнемпоказывают значительно меньшую выживаемость в сравнении с пациентами с низким уровнем этого белка. Поэтому разработка методов, позволяющих количественно оценивать экспрессию и белок-белковые взаимодействия белка , являются актуальными. Технической задачей изобретения является создание рекомбинантной плазмиды,обеспечивающей возможность точной количественной оценки экспрессии и белокбелковых взаимодействий транскрипционного кофактора . Изобретение относится к генной инженерии,биохимии, биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для создания метода ранней диагностики рака. Регуляция экспрессии генов на уровне инициации транскрипции сиквенс-специфичными ДНК-связывающими белками является наиболее важной в развитии многоклеточных организмов и гомеостаза. Набор активных транскрипционных факторов находящихся в ядре в большой степени диктует выход продуктов транскрипции из ядра, и следовательно пролиферативный и дифференцированный фенотип клетки. Транскрипционные регуляторные белки являются примером модульности в архитектуре с независимыми,функционально раздельными доменами для локализации в ядре, сиквенсспецифичного связывания с ДНК, гетеро- или гомоолигомеризации, активации и репрессии транскрипции. Примерами доменов являются репрессирующие домены первоначально идентифицированные в белках человеческих клеток,как консервативные аминокислотные последовательности, содержащие много остатков 2-2 (С 2 Н 2) на С-конце, названы какбелки с цинковыми пальцами. Примерно от 300 до 700 человеческих генов кодируют белки с цинковыми пальцами, треть из которых содержит -домен ( Е. .,//. . . . ., 1991, .88, .36083612).домен состоит примерно из 75 аминокислотных остатков, и его наличие связано с репрессирующей активностью. Белок КАР 1 (-1), также известный как 1 (1) и 28 (28) является важным кофактором белковс цинковыми пальцами ( .,//. . ., 2000,.20, .18, .6970-6983).это большой белок, который может взаимодействовать со множеством факторов, вовлеченных, как в активацию генов, так и в их репрессию. На -концесодержит 4 консервативных структурных домена, включая, В , лейциновые застежки -, которые вместе называютсяилидоменами. Центральная частьсодержит пентапептидный участок , который позволяет взаимодействовать с гетерохроматиновым белком НР 1. Участоки бромодомен расположены на С-конце . Показано, что вышеперечисленные домены данного белка выполнят важную роль в образовании больших комплексов, которые предположительно вовлечены в образование гетерохроматиновых комплексов. Например, домен взаимодействует с НР 1 (, . .,.//. .., 1999, .19, .6, .4366-4378), который в свою очередь может связываться с гистоном Н 3,метилированном на лизине 9 (Н 39 е 3). Таким образом, , бромо- идомены 2 предположительно работают кооперативно в образовании конденсированного гетерохроматина,характеризующегося низким ацетилированием гистонов, высоким Н 39 е 3 и связыванием с НР 1. Регуляция белканарушена во многих видах опухоли и преположительно это является критическим для развития неопластических трансформации, например, в случае рака желудка,пациенты с высоким уровнемпоказывают значительно меньшую выживаемость в сравнении с пациентами с низким уровнем этого белка ( Т.,//. . ., 2010, .17, .821-828). Поэтому разработка методов,позволяющих количественно оценивать экспрессию и белокбелковые взаимодействия белка , являются актуальными. Сконструирована рекомбинантная плазмида 3.1 (фиг.1) размером 7430 п.н.,содержащая следующие конструктивные элементы фрагмент ДНК векторной плазмиды 3.1 размером 5374 п.н., на основе промотора(цитомегаловирусный промотор),с генами устойчивости к ампициллину и неомицинуфрагмент, кодирующий участок гена АР 1,содержащий 1-связывающий или домен или его мутантную версию с доменом , которая не связывается с гетерохроматиновым белком НР 1 ( .//, 2011, .31, . 9,.1833-1847), конъюгированного с пептидом акцептором биотина ВАР . В плазмидную конструкцию также включены последовательности, бицистронного транскрипционного элемента,позволяющего экспрессировать два белка из одного транскрипта и селекционного маркера 2 (альфа цепи рецептора интерлейкина 2) между сайтамииразмером 1436 п.н. ( .,//.., 1988, .170, .341-348). В структуре плазмиды имеется также консенсусная последовательность Козакперед ВАР,важная для инициации трансляции ( М.//.., 1991, .115, .4, Р.887-903) в эукариотических клетках. Наиболее близким к заявляемой плазмиде прототипом является рекомбинантный вектор экспрессии на основе плазмиды с промотором от вируса мышиной лейкемии (,или ). Данный вектор разработан для методики выделения и очистки мультимерных белковых комплексов из клеток млекопитающих ( .,. //. 2003, .370, .430-444). Недостатком данного прототипа является то, что в этой плазмиде используется слабый промотор, в то время как в заявляемой плазмиде имеется более сильный промотор , что важно,когда необходима высокая экспрессия интересующего белка в случае транзиентной трансфекции клеток. Другим недостатком прототипа является наличие домена ВАР,кодирующего пептид, к которому биотин-лигаза достаточно легко присоединяет биотин ( 2009/0275081 1, 30 января 2009). В заявленной плазмиде этот домен ВАР оптимизирован и соответственно обладает более широким диапазоном линейности биотинилирования ( М.,// , 2013, .23, Р.331-340). Технической задачей изобретения является создание рекомбинантной плазмиды,обеспечивающей возможность точной количественной оценки экспрессии и белокбелковых взаимодействий транскрипционного кофактора . Поставленная техническая задача достигается новой сконструированной плазмидой 3.1,размером 7430 п.н.,обеспечивающей необходимый уровень экспрессии рекомбинантного белка. в эукариотических клетках. Способ конструирования плазмиды заключается в синтезе гена, состоящего из домена ВАР и участка гена , содержащий НР 1-связывающий ( или ) или мутантный 1-несвязывающийдомен в одной рамке трансляции, между которыми нет стоп-кодонов. Сначала при помощи ПЦР получают участок гена , фланкированный сайтами узнавания для эндонуклеаз рестрикциии . Для этого моделируют и синтезируют праймеры с учетом наличия сайтови ,позволяющий клонировать этот ген в вектор,созданный на основе 3.1, содержащий домен ВАР ( .,//.,2011, .10, .4416-4427). Заявляемая плазмида состоит из следующих элементовДНК векторной плазмиды 3.1 размером 5374 п.н.- фрагмент, кодирующий участок гена) или мутантный НР 1-несвязывающийдоменКонсенсусная последовательность Козакперед ВАР Домен ВАРПоследовательность,и селекционного маркера 2 между сайтамииразмером 1436 п.н. Физическая карта плазмиды 3.1 с указанием генетических маркеров приведена на фиг.1, гденуклеотидная последовательность участка гена транскрипционного кофакторачеловека,содержащий дикий тип, 1-связывающий ( или ) или мутантный 1-несвязывающийдомен, ВАР 1070 домен пептида акцептора биотина,транскрипционного элемента,позволяющего экспрессировать два белка из одного транскрипта,2 (-2 ) - селекционный маркер, - селекционный маркер гена устойчивости к ампициллину. Отличием предлагаемой плазмиды от прототипа является наличие в ее составе участка гена транскрипционного кофакторачеловека,кодирующего синтез этого белка, дикого типа или мутанта (прогностического маркера на наличие рака желудка), более сильного промотораи оптимизированного домена ВАР, позволяющего проводить более точные количественные измерения экспрессии и взаимодействии белка . Сущность изобретения поясняется следующими примерами конкретного выполнения изобретения. Пример 1. Конструирование плазмиды 3.1 Для получения участка генабыл проведен дизайн олигонуклетидов-праймеров, содержащих сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикциии, что позволило провести клонирование по этим сайтам в векторную плазмиду 3.1 Олигонуклеотиды-праймеры Для клонирования генаиспользовали плазмиды 2.1 и 2.1 (,М. .//. . ., 2000, .20, .64496465), которые использовали в качестве матрицы для ПЦР-амплификации. Полученные ампликоны генадикого типа и мутанта клонировали в вектор 3.1 Условия ПЦР денатурация 94 С- 15 сек, отжиг 56 С - 30 сек,элонгация 72 С - 2 мин, количество циклов - 20. Протокол реакции синтеза гена Смешали смеси 1 и 2 и загрузили в ПЦР амплификатор (таблица 1 и 2). Часть продуктов ПЦР-реакции (10 мкл или 1/5 часть от объема) для визуализации подвергали электрофорезу в 0.8 агарозном геле, затем окрашивали с помощью бромистого этидия. Оставшуюся часть ПЦРпродуктов (40 мкл) помещали в пробирки с фильтрующими элементами из набора для очистки продуктов ПЦР фирмы(номер по каталогу Р 36461, . А, 03/05) и добавляли 300 мкл воды. Центрифугировали в центрифуге при 1000 , в течение 15 мин, для удаления солей и праймеров. Далее в фильтрующий элемент, содержащий амплифицированную ДНК, добавляли 20 мкл воды,переворачивали, вставляли в новую пробирку из набора и центрифугировали 2 мин при 1000 . подвергали гидролизу рестриктазамии(20 е.а. в 20 мкл реакционной смеси) в соответствующих буферных растворах при 37 С в течение 2 часов. Гидролизат разделяли электрофорезом в 0.8 агарозном геле, затем окрашивали с помощью бромистого этидия. Визуализированные в УФ-свете фрагменты вырезали, помещали кусочки геля в пробирки, из набора для выделения ДНК из агарозного геля фирмы(номер по каталогу 050) и центрифугировали при 5000 , 10 мин. Лигирование полученных на предыдущей стадии вектора и фрагмента ДНК осуществляли с помощью лигазы фага Т 4 в течение ночи при 4 С. После трансформации компетентных клеток Е.штамма 5, и отбора клонов, несущих рекомбинантные плазмиды со встроенным геном,получали плазмиды 3.1 и 3.1 Пример 2. Экспрессия рекомбинантных белков ВАР.ар 1 в клетках НЕ 293 Т Экспрессию рекомбинантных белков из полученных плазмид 3.1 .ВАР.ар 1, осуществляли в клетках НЕ 293 Т с применением кальцийфосфатного метода ( ,//, 1973, .52,2, . 456-467). Для получения более исчерпывающей информации, включающей наряду с уровнем экспрессии, также данные о белок-белковых взаимодействиях,проведен эксперимент с экспрессией векторов . или . совместно с За 1 день до трансфекции посеяли 200,000 клеток НЕК 293 Т в каждую лунку 6 луночной планшеты в 2 мл среды ,содержащей 10 фетальной телячьей сыворотки и 1 смеси антибиотиков пенициллинна и стрептамицина. На следующий день за 1 час до трансфекции поменяли среду на свежую 2 мл. Для проведения трансфекции в расчете на 1 лунку приготовили по две пробирки на 1.5 мл,4 25 мкл 10.0 мкл 10.0 мкл 1.0 мкл 4.0 мкл промаркированные (1 А, 1 В или 2 А, 2 В и т.д., 8 А,8 В). В одну пробирку (раствор А) загрузили 220 мкл воды, 31 мкл 2 М раствора хлорида кальция и рассчитанное согласно таблице 3 внизу количество плазмидных ДНК. Во вторую пробирку (раствор В) загрузили 250 мкл буферного раствора 2 х(Состав буферного раствора 2 х (200 )2 г, С 0.15 г, Глюкоза 0.4 г,3.2 г, 24 0.0426 г,должно составить 5.9, довелидо 7.0 добавлением небольшими порциями 1 н р-ра ,отфильтровали через стерильный фильтр фирмыи хранили при 4 С). Затем медленно по каплям добавляли раствор А к раствору В,оставляли на 15 минут и затем добавляли полученную смесь к клеткам НЕК 293 Т. На следующий день поменяли среду на новую. За 5 минут до сбора клеток поменяли среду на , приготовленную добавлением 10 мкл раствора биотина (1 мг/мл) и 100 мкл 50 мМ( 7.35) к 2 мл среды (мечение биотином составляло 5 минут). Клетки собирали через 48 часов, удалили среду, затем добавили 1 мл раствора, ресуспендировали и перенесли в пробирку на 1.5 мл. Затем пробирки центрифугировали при 4 С,700 , 5 минут, удаляли супернатант и добавляли к клеткам по 100 мкл раствора буфера ,содержащего 0,5 тритона (Состав буферного раствора- 100, 300 М сахароза, 10 М ,7.5, 3 М 2, 1 М , 1.2 М, 0.5 Х-100), пипетировапи несколько раз и центрифугировали при 4000 , 5 минут. В результате на данном этапе метода были получены ядра клеток НЕК 293 Т, которые можно было заморозить до -20 С или сразу добавить 80 мкл буфера без тритона,подвергнуть соникированию (для разрушения геномной ДНК и уменьшения вязкости) и добавить 40 мкл загрузочного буфера 3 Х (Состав на 10 мл 2,4 мл 1 М Трис, рН 6.8, 0.8 г , 4 мл глицерина, 0.01 бромфенолового синего, 1 мл бета-меркаптоэтанола и 2.8 мл воды). Пробирки встряхнули, нагрели при 98 С (5 минут) и открутили на миницентрифуге на максимальной скорости. Анализ лизатов ядер с помощью иммуноблоттинга осуществляли согласно методике из сборника ( ,.,, 1999, 282). Таблица 3 Расчет количеств плазмид для трансфекции 1 2.1 2.1 Согласно данным иммуноблота с анти-антителами уровни экспрессии мутантной формы и дикого типа фрагментов 1 были почти идентичны (фиг.2, верхний блот). Однако, уровень биотинилирования рекомбинантного белка.1 (лунка 3, фиг.2, нижний блот) был значительно выше чем мутантной версий.1 (лунка 4). В контрольных лунках 1 и 2 без добавления биотина наблюдали ожидаемое отсутствие сигнала. Интересно отметить результаты трансфекции, в которых дополнительно добавляли компетиторы - немаркированные белки 1 и Кар 1, не содержащие ВАР или -маркер. Одновременная экспрессия компетитора 1 подавляла биотинилирование (лунка 5), в то время как экспрессия мутантного компетитора Кар 1 не оказывала никакого влияния на уровень биотинилирования (лунка 7). Таким образом,приведенные данные свидетельствуют о том что сконструированная плазмида 3.11 обеспечивает высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка .1, достаточного для работ, связанных с количественной оценкой его экспрессии в эукариотических клетках и изучения белокбелковых взаимодействий. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Рекомбинантная плазмида 3.1-1, кодирующая рекомбинантный белок 1 (транскрипционный кофактор человека) имеющая размер 7430 п.н. и содержащая следующие конструктивные элементыДНК векторной плазмиды 3.1 размером 5374 п.н.- фрагмент, кодирующий участок гена 1, содержащий 1-связывающий ( или) или мутантный НР 1-несвязывающийдоменКонсенсусная последовательность Козакперед ВАРДоменПоследовательность ЕМС-) цитомегаловирусный промотор- селекционный маркер гена устойчивости к ампициллинуселекционный маркер гена устойчивости к неомицину.