Способ выявления и идентификации кампилобактерий на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР)

(51) 61 39/106 (2006.01) 01 33/531 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии, а именно к лабораторной диагностике кампилобактериза, и может быть использовано для решения актуальных задач ветеринарной диагностики, в частности, для выявления и родовой идентификации кампилобактерий в клиническом материале, а также в бактериальных культурах. Предложен способ выявления и идентификации кампилобактерий на основе полимеразной цепной реакции, позволяющий детектировать возбудителя кампилобактериоза при проведении диагностических исследований и дифференцировать кампилобактерии от других возбудителей инфекционных заболеваний а также от представителей сапрофитной микрофлоры Внедрение в практику данного способа позволит сократить время постановки диагноза до одного рабочего дня и снизить себестоимость диагностики.(72) Шевцов Александр Борисович Абишева Гульзада Думановна Шевцова Елена Сергеевна Муканов Касым Касенович Каиржанова Алма Дуйсенбайкызы Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ КАМПИЛОБАКТЕРИЙ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР) Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии, а именно к лабораторной диагностике кампилобактериза, и может быть использовано для решения актуальных задач ветеринарной диагностики, в частности, для выявления и родовой идентификации кампилобактерий в клиническом материале, а также бактериальных культур. Несмотря на значительный прогресс в контроле и борьбе с инфекционными заболеваниями,кампилобактериозные инфекции являются проблемой животноводства во всем мире с большим экономическим ущербом, связанных со снижением продуктивности животных, а также с затратами на проведение противоэпизоотических мероприятий. Кроме того, зараженные кампилобактериями животные и продукция животноводства являются причиной инфицирования людей. Основными путями инфицирования людей кампилобактериями являются потребление не пастеризованного молока,сырое или недоваренное мясо домашней птицы,загрязненная вода, а также прямой контакт с зараженными людьми и домашними животными. Эпидемиологические исследования доказали, что 55-80 случаев кампилобактериоза людей связаны с потреблением продуктов домашней птицы, на долю КРС и мелкого рогатого скота приходится от 20 до 40. Кампилобактериозом ежегодно болеют более 2,4 миллионов человек с проявлением диареи,лихорадки, головной боли, тошноты и рвоты. В некоторых случаях(11000) осложнения кампилобактериоза могут привести к острой аутоиммунной воспалительной полирадикулоневропатии (синдром Гийена - Барре). Уровень техники. Классическая бактериологическая диагностика кампилобактериоза приводит к искажению реальной картины распространенности данного заболевания,в связи со сложностью культивирования кампилобактерий и высокой стоимостью бактериологических исследований. Так, в 2002 году по всей России официально зарегистрировано всего 461 случай кампилобактериоза (показатель на 100 тыс. населения - 0,32), при сохранении инфицирования сальмонеллезом на каждые 100 тыс. за тот же период 34,27. В Украине регистрация кампилобактериоза также остается на низком уровне, и заболеваемость составляет менее одного случая на 100 тыс. населения в год. Тогда как,целевой мониторинг кампилобактерий в структуре острых кишечных инфекций у людей в Западных странах позволяет выявлять от 50 до 100 случаев кампилобактериоза на 100 тысяч населения. Современные методы диагностики такие как иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР) могут ускорить и сократить затраты на постановку диагноза при кампилобактериозе у людей и животных, а также при проверке безопасности пищевой продукции. Сравнительные испытания доказали эффективность ПЦР при диагностике кампилобактериоза. Результаты анализа продуктов на присутствие 2 классическим и ПЦР методами дали 100 идентичность. Литературные данные свидетельствуют о перспективности разработки ПЦР тест-систем для диагностики кампилобактериоза. В последнее десятилетие в ветеринарной практике для диагностики инфекционных заболеваний активно используется ПЦР. В диагностических лабораториях США и Европы выявление кампилобактерий методом ПЦР стало рутинной практикой. Аналоги изобретения. В результате проведенного патентного поиска на веб-ресурсах, содержащих реестр казахстанских,евразийских и российских патентов, заявки описывающие способы выявление и идентификацию кампилобактерий на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) найдены не были. Тем не менее, похожие работы описываются в зарубежной литературе. Например,. с соавторами предложили способ идентификации кампилобактерий на основе амплификации фрагмента 16 гена, что позволило дифференцировать видыот других разновидностей входящих в отряд.,,.// . . - 1996. - . 147. - 707718. разработали протокол для одновременной идентификации кампилобактерий,сальмонелл и шигелл методом ПЦР с детекцие в режиме реального времени в присутствие интеркалирующего красителя. В своем исследовании они также использовали праймеры подобранные к нуклеотидной последовательность 16 гена.,Е.Н.,., .,,, ,// . . . - 2013. - . 51. -. 2822-2829 Рибосомный генный регионРНК является самым часто используемым для микробной идентификации. Высокая популярность нуклеотидных последовательностей данного региона связана с наличием в нем высоко консервативных и вариабельных участков пригодных для подбора праймеров для видовой и родовой идентификации, а также, в связи с тем, что нуклеотидные последовательности гена 16 рибосомальной РНК известны фактически для всех микроорганизмов, представляющих интерес для медицины и ветеринарии. Тем не менее,нуклеотидная последовательность 23 более вариабельна чем 16 и поэтому обладает высоким потенциалом для использования ее последовательности при разработке молекулярно генетических тестов дифференциации микроорганизмов на родовом и видов уровнях. Отличительными признаками данного способа от прототипов является использование в качестве мишени для ПЦР амплификации нуклеотидной последовательности 23 гена, а также Результаты оценивают методом электрофореза в агарозном геле в присутствии интеркалирующего красителя этидиум бромида по наличию в дорожках специфического ПЦР продукта молекулярной массой 250 пар нуклеотидов. Сведения,подтверждающие возможность осуществления изобретения. Сущность изобретения поясняется высокой специфичностью и низким пределом чувствительности разработанного спососба Пример 1 Специфичность ПЦР способа была проверена на 50 коллекционных образцах ДНК (фиг.1). ПЦР реакция была выполнена в общем объеме 25 мкл. В состав реакционной смеси входили праймеры по 10 пмоль каждого ДНК кампилобактерий в концентрации 3 нг и ДНК остальных видов бактерий в концентрации 15 нг в реакции, ДНК животных и птиц в концентрации 100 нг (таблица 2) 1 Ед.0,2 каждого дНТФ 1-х ПЦР буфер (, 10(объем/объем)Р 40) ионы магния от 2,0 М воды до 25 мкл. Программа ПЦР амплификации приведена в таблице 1 Таблица 1 Программа ПЦР амплификации структура нуклеотидной последовательность олигонуклеотидов (праймеров). Сущностью изобретения является разработка способа выявления и идентификации кампилобактерий на основе полимеразной цепной реакции для диагностики бруцеллеза и родовой идентификации бактериальных культур. Задачей изобретения является разработка способа, позволяющего детектировать возбудителя кампилобактериоза при проведении диагностических исследований и проводить дифференциацию кампилобактерий от других возбудителей инфекционных заболеваний а также от представителей сапрофитной микрофлоры. Технический результат. Предложен способ выявления и родовой идентификации кампилобактерий на основе полимеразной цепной реакции, позволяющий сократить время постановки диагноза. Результат достигается выявлением кампилобактерий методом полимеразной реакции с праймерами, подобранными к нуклеотидной последовательности 23 гена. Праймеры на этот ген имеют следующие последовательности 231 -53 Са 231 -5 3 Процесс Денатурация Денатурация Отжиг Элонгация Образцы ДНК используемые для оценки чувствительности.ДНК КРС ДНК МРС ДНК птицы Отрицательный контроль Отрицательный контроль Отрицательный контроль Отрицательный контроль 1-54 образцы согласно таблице 2, М - маркер молекулярного веса(100 - 10000 п.н., от 100-1000 шаг 100 п.н.) Фиг.1 Электрофорерограмма оценки специфичности разработанного протокола выявления кампилобактерий Специфический ПЦР продукт молекулярной массой 250 п.н. выявлен в дорожках содержащих ДНК кампилобактерий. В дорожках с ДНК бактерий других видов, включая генетически близкий вид Н.и ДНК животных и птиц, ПЦР продукты отсутствуют. Таким образом, неспецифический отжиг праймеров на нецелевые фрагменты ДНК не происходит даже при содержании ДНК матрицы от 2 до 8106 геномных эквивалента (расчет количества копий ДНК проводили с использованием интернет ресурса////.). Полученные результаты указывают на высокую специфичность разработанного способа. С целью оценки чувствительности разработанного способа было проведено двукратное разведении ДНК 4 видов кампилобактерий (таблица 2). В анализе была использована программа ПЦР амплификации и состав реакционной смеси как и при оценке специфичности ПЦР протокола. Таблица 2 Концентрация ДНК при оценке чувствительности Номер п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 Концентрация ДНК нг 5 2,5 1,25 0,625 0,3125 0,15625 0,078125 0,0390625 По окончании ПЦР амплификации проводили электрофоретический учет результатов. На фиг.2 представлены результаты оценки чувствительности протокола. Концентрация ДНК нг 7,62939 Е-05 3,8147 Е-05 1,90735 Е-05 9,53674 Е-06 4,76837 Е-06 2,38419 Е-06 1,19209 Е-06 Отриц. контроль Фиг.2 - Электрофорерограмма результатов оценки чувствительности протокола с праймерами-23-1 и -23- 1 При постановке ПЦР с разведениями ДНК С.и С.отчетливые ПЦР продукты видны до 18 разведения, что соответствует 38 фг. При титровании ДНК С.,чувствительность составила 152 фг, разведение номером 16, а для С..- 76 фг. Как видно из рисунка имеется прямая корреляция между концентрацией ДНК и уровнем интенсивности ПЦР продуктов. Концентрация ДНК при которой отчетливо регистрируется ПЦР продукт варьирует от 38 до 152 фг, или от 16 до 60 геномных копий. Чувствительность способа в 16-60 геномных копий достаточна для его использования при диагностике кампилобактериоза. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1 -24 образцы согласно таблице 2,- маркер молекулярного веса(100 - 10000 п.н., от 100-1000 шаг 100 п.н.) 4 Способ выявления и идентификации кампилобактерий на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), предусматривающий выделение ДНК, постановку ПЦР, отличающийся тем, что в качестве затравок ПЦР используют праймеры,подобранные к нуклеотидной последовательности 23