Способ диагностики риска развития рестеноза в казахской популяции после стентирования коронарных артерий

(51) 12 1/68 (2006.01) 12 15/11 (2006.01) 01 33/48 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Целью исследования является оценка генетической предрасположенности развития рестеноза у пациентов, которым необходимо стентирование коронарных артерий, и у пациентов,которым стентирование проведено ранее. Цель исследования достигается следующим образом. Выделяется ДНК из периферической крови пациента. Генотипирование на выявление клинически значимых полиморфизмов проводят,используя специфические праймеры и флуоресцетно-меченые зонды. Выявление генотипирования полиморфизмов проводят на амплификаторе -96(США). Интерпретацию результатов проводят,используя программное приложение амплификатора. Программное приложение самостоятельно определяет генотип (дикий или минорный аллель). На основе результов генотипирования делается оценка риска развития рестеноза. Применение данного способа диагностики риска развития,основанное на генетическом тестировании, перед выполнением стентирования позволит определять пациентов с высоким риском развития рестеноза. Назначение профилактических мер будет способствовать снижению частоты рестенозирования после проведения процедуры коронарного стентирования.(72) Тарлыков Павел Викторович Айткулова Акбота Маратовна Искакова Айша Нурбековна Тайжанова Дана Жумагалиевна Жолдыбаева Елена Витальевна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РИСКА РАЗВИТИЯ РЕСТЕНОЗА В КАЗАХСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ ПОСЛЕ СТЕНТИРОВАНИЯ КОРОНАРНЫХ АРТЕРИЙ(57) Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской генетике, и может быть использовано для решения актуальных задач в кардиологии для прогнозирования развития рестеноза у пациентов после проведения им процедуры стентирования. Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской генетике, и может быть использовано для решения актуальных задач в кардиологии для прогнозирования развития рестеноза у пациентов после проведения им процедуры стентирования. Применение данного способа диагностики, основанное на генетическом тестировании перед выполнением стентирования,позволит определять группы риска. Назначение профилактических мер будет способствовать снижению частоты рестенозирования после коронарного стентирования. Ишемическая болезнь сердца (ИБС) является одной из основных причин ранней инвалидизации и смертности трудоспособного населения во всех развитых странах мира. Заболеваемость ИБС в Республике Казахстан в последнее время имеет тенденцию к неуклонному росту. В 2007 году в Казахстане было зарегистрировано 305 697 больных с ИБС. В 2012 году в Казахстане заболеваемость ИБС на 100 000 населения составила 507.4 случаев. Также в 2012 году 59914 новых случаев ИБС было зарегистрировано в амбулаторных учреждениях(официальные данные медицинской статистики РК,. .). Широко распространенным и довольно эффективным способом лечения ИБС является коронарное стентирование. Однако стентирование не обладает абсолютной эффективностью и в большинстве случаев после стентирования могут возникать рестенозы (повторное сужение сосудов). Литературные данные свидетельствуют о том, что рестеноз развивается в 30-32 случаев после ангиоплатсики и в 12-30 случаев после внутрикоронарного стентирования (Е., 2008). На фоне широкого применения стентов проблема рестенозов после их имплантации стала серьезной клинической проблемой. В настоящее время известно, что генетические факторы вовлечены в развитие рестенозов. (, 2000,., 2013,., 2014). В настоящее время известен ряд масштабных исследований, целью которых является изучение причин возникновения рестенозов2 . Аналоги изобретения. Аналогом данного изобретения выбрана работа. . ,выполненная в соавторстве, которая является результатом многолетних исследований. Авторами была сформирована панель генетических маркеров,ассоциированных с риском развития рестенозов, и предложен способ генетического тестирования 11 полиморфизмов, шести генов (таблица 1). Таблица 1 Значимые 6 генетических маркеров, ассоциированные с риском развития рестеноза Исследования . .и его соавторов были проведены на европейской популяции 2. В настоящее время хорошо известный факт, что генетические маркеры этнически специфичны. Данные, полученные на одной популяции,полностью нельзя экстраполировать на другую популяцию. В связи с вышеописанным фактом,нами были выбраны генетические маркеры,предлагаемые в работе . . ,которые мы исследовали на казахской популяции. В Казахстане до настоящего исследования работ по изучению вклада генетической составляющей в развитие рестенозов не проводились. Отличительными признаками предлагаемого нами способа от прототипа является то, что наше исследование проведено на казахской популяции и это позволило соотвественно выявить другие генетические маркеры, которые ассоциированы с развитием рестеноза в казахской популяции. В экспериментальную выборку включали образцы клинического материала (венозная кровь) от больных ИБС с рестенозом. В качестве контрольной группы служили образцы клинического материала(венозная кровь) от больных ИБС, у которых не развился рестеноз после стентирования в течение 6 месяцев. В исследование были включены пациенты,относящиеся к казахскому этносу после подписания ими или их ближайшими родственниками информированного согласия об участии. В таблице 2 представлены антропометрические и биохимические показатели. Таблица 2 Антропометрические и биохимические характеристики исследуемых групп Мужчины(307) Без рестенозов Рестенозы Возраст, (года) ИМТ (кг/м 2) Курение,Гипертензия,Холестерин, (/) Случаи ССЗ у 51(22.9) 32(38.1) родственников,Примечание ИМТ - индекс массы тела,-количество человек. Для статистической обработки данных генотипирования использовали пакет программ Женщины (71) Без рестенозов Рестенозы (8) Таблица 3 Значимыегенетических маркеров, ассоциированные с риском развития рестеноза в казахской популяции При сравнении таблицы 1 и 3 видно, что только один значимый полиморфизм в гене К-лизин ацетилтрансферазы 2 В в работе . .совпадает, другиеотличаются. Таким образом, приведенные в таблице 3 шестьявляются специфическими и клинически значимыми для казахской популяции. Имеется патент Российской Федерации Способ прогнозирования развития рестеноза после стентирования коронарных артерий стентами без лекарственного покрытия. В данном изобретении определяются генотипы полиморфизмов 298 гена эндотелиальной синтазы оксида азотаи 98 гена глутатионпероксидазы-1 (-1). Предлагаемый способ используется для прогнозирования развития рестеноза после стентирования коронарных артерий с использованием стентов именно без лекарственного 3 покрытия. Определение генотипа проводится методом анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. В предлагаемом нами способе генотипирование осуществляется с использованием более современной технологии метода полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени,клинически значимые полиморфизмы для казахской популяции отличаются от полиморфизмов, предложенных в работе Шуваловой Ю.А., 2008. Патентный поиск через ресурс по тематики рестенозов показал, что имелся патент 22972 Способ неинвазивной диагностики рестеноза внутри стента и прогрессирования атеросклероза после коронарного стентирования. Способ не связан с генотипированием и определением риска развития рестенозов. Патентный поиск в реестре евразийских патентовпоказал, что охранные документы по данной тематике отсутствуют. Патентный поиск в Гены ТромбомодулинФибриногенК (лицин) ацетилтрансфераза 2 В (АТ 2 В) Тромбопоэтин (2 ТНРО) Интерлейкин 6 (6) Фактор некроза опухоли В том случае, если у пациента присутствуют только дикие аллели исследуемых полиморфизмов, то есть аллелигена,гена , Т гена АТ 2 В, Т гена 2, гена 6,гена , то риск развития рестеноза у него низкий- присутствует в генотипе минорный аллель А полиморфизма /А в гене , то риск развития рестеноза у пациента высокий. Так как согласно таблице 3 отношение шансов- 3.281 при вероятности Р - 0.001246.- присутствует в генотипе один или более одного следующие минорные аллели минорный аллель А полиморфизма /А в гене(тромбомодулин),минорный аллель А полиморфизма /А в гене фибриногена, то риск развития рестеноза средний. На основе результов генотипирования делается оценка риска развития рестеноза. Технический результат. Предложена для кардиологических отделений медицинских учреждений схема генотипирования полиморфизма единичного нуклеотида на основе метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени перед выполнением стентирования, которая 4 регистре европейского патентного ведомства показал, что патенты по подаваемой нами тематике также отсутствуют. Сущностью изобретения является оценка генетической предрасположенности и диагностики риска развития рестеноза для выявления пациентов,которым необходимо стентирование коронарных артерий, и включение их в группы риска. Применение данного способа позволяет определять пациентов с риском развития рестеноза, тем самым своевременно назначать им профилактику, что будет способствовать уменьшению рестенозирования. Сущность изобретения достигается проведением генотипирования полиморфизмов единичного нуклеотида, ассоциированных с риском развития рестеноза после стентирования коронарных артерий в казахской популяции, используя метод ПЦР в режиме реального времени. Определяют следующие генотипы у пациента. позволит определять риск развития рестеноза у пациентов, что достигается за счет выявления в генотипах пациентов минорных аллелей полиморфизмов, приводимых в таблице 2. Способ осуществляют следующим образом Первоначально выделяется ДНК из периферической крови пациента. Принцип метода основан на использовании высоких концентраций солей для удаления белков. Метод быстрый,безопасный и не требует использования дорогостоящих и экологически опасных реагентов,таких как фенол и хлороформ. Необходимые материалыпробирки различного объемацентрифугаморозильная камера 100 этанолТЕ буфер 10 мМ Трис-НС, 1 мМ ЭДТАпротеиназа К (10 мг/мл). Буфер А 0,32 М сахароза 109,5 г сахарозы 10 мМ Трис-НС,7,6 10 мл 1 М Трис-НС 7,6 5 мМ 2 5 мл 1 М 2 1 100 Довести объем до 1 литра деионизированной водой. Стерилизовать растворы автоклавированием,потом добавить 10 мл 100. Буфер В 25 мМ ЭДТА,8,0 50 мл ЭДТА 8,0 75 мМ 40 мл 5 Довести объем до 1 литра деионизированной водой. Стерилизовать автоклавированием. Насыщенный раствор(приблизительно 6 М) Растворить 35 гв деионизированной воде,общий объем 100 мл. Если в растворе нет осадка,добавить 2 ги размешать. Повторять до тех пор покане перестанет переходить в раствор(растворяться). Стерилизовать фильтрованием. 1. Изолировать ядра из крови (кровь, собранная в пробирки с ЭДТА). Для этого - 9 объемов Буфера А,хорошо размешать и держать на льду в течение 2 мин (обычно это делается в пробирке на 50 мл, к 3-6 мл крови взятой с ЭДТА, добавляется Буфер А до верха). 2. Центрифугировать со скоростью 3000 об./мин при 4 С, 15 мин. Осторожно слить супернатант. 3. Ресуспендировать осадок ядер в 5 мл Буфера В и перенести в полипропиленовые центрифужные пробирки объемом 15 мл. 4. Добавить 500 мкл 10 и 55 мкл протеиназы К (10 мг/мл). Это также может быть более дешевая проназа до концентрации 200 мкг/мл. 5. Инкубация при 37 С в течение ночь на низкоскоростном рокере или орбитальном шейкере. Можно и без шейкера, если его нет. 6. Добавить 1,4 мл насыщенного раствора(приблизительно 6 М) в каждую пробирку. Хорошо перемешать 15 мин. 7. Центрифугировать пробирки со скоростью 3000 , 15 мин на низкоскоростной центрифуге. 8. Перенести супернатант в другую полипропиленовую пробирку объемом 15 мл,оставляя приципитированный осадок белков. 9. Добавить строго 2 объема 100 этанола комнатной температуры и перевернуть пробирку несколько раз пока приципитат ДНК не станет видимым. 10. Извлечь ДНК с помощью пластикового шпателя или носика пипетки (можно расщепить немного кончик носика, чтобы ДНК лучше наматывалась). Перевернуть, что бы стек спирт,подождать 20-30 мин до некоторого высыхания. Перенести в пробирки объемом 1.5 мл, содержащие 500 мкл ТЕ буфера. Оставить ДНК растворяться на 2 часа при 37 С. Выделенную ДНК оценить количественными и качественными методами. Генотипирование на выявление клинически значимых полиморфизмов проводят, используя специфические праймеры и флуоресцетно-меченные зонды, заказанные в фирме, США. Выявление генотипирования полиморфизмов проводят на амплификаторе -96(- США). Интерпретацию результатов проводят, используя программное приложение амплификатора. Программное приложение самостоятельно определяет генотип (дикий или минорный аллель, фиг.1). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики риска развития рестеноза в казахской популяции после стентирования коронарных артерий, включающий генотипирование полиморфизмов единичного нуклеотида,ассоциированных с риском развития рестеноза методом ПЦР в режиме реального времени,отличающийся тем, что у пациентов казахской популяции определяют генотипы следующих полиморфизмов 1042579 гена , 155483708 гена , 2929404 гена КАТ 2 В, 6141 гена 2, 1800796 гена 6,800629 гна, и,- при выявлении у пациента диких аллелей исследуемых полиморфизмов, - прогнозируют низкий риск развития рестеноза(КАТ 2 В), либо аллеля С полиморфизма Т/С в гене тромбопоэтина (2), либо аллеля С полиморфизма / в гене интерлейкина 6 (6),либо аллеля А полиморфизма / фактора некроза опухоли , - прогнозируют средний риск развития рестеноза- при выявлении аллеля А полиморфизма / в гене , - прогнозируют высокий риск развития рестеноза.