Способ получения живой сухой вакцины против инфекционной бурсальной болезни кур

(51) 61 39/12 (2006.01) 12 7/00 (2006.01) 12 31/10 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ вируса, обладающего низкой реактогенностью и высокой иммуногенной эффективностью,и применении технологий, позволяющих получать биомассу штамма вакцинного вируса с высоким титром. Способ получения живой сухой вакцины инфекционной бурсальной болезни кур,включающий накопление биомассы вируса инфекционной бурсальной болезни кур и стабилизацию защитной средой,а также сублимационное высушивание, отличающийся тем,что в качестве активного иммуногена используют биомассу штамма -0002 16/1 вируса инфекционной бурсальной болезни кур,стабилизируют защитной средой, содержащей в конечной концентрации 4 сахарозы, 3 гидролизатлактоглобулина,1 желатина,и сублимируют во флаконах в объеме по 1,0 см 3 или 2 см 3 или 4 см 3.(72) Кутумбетов Леспек Бекболатович Жантелиева Лаура Оразакыновна Мырзахметова Балжан Шайзадаевна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ СУХОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ КУР(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к способу получения живой сухой вакцины инфекционной бурсальной болезни кур. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в использовании штамма Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к способу получения живой сухой вакцины против инфекционной бурсальной болезни кур. Известен способ получения живой сухой вакцины против инфекционной бурсальной болезни кур, включающий накопление биомассы вируса инфекционной бурсальной болезни птиц, и стабилизацию защитной средой,а также сублимационное высушивание Патент Российской Федерации 2272649, кл. С 12 7/00, А 61 39/12(2006.01). Недостатком известного способа получения вакцины против инфекционной бурсальной болезни кур является высокая реактогенность. Задачей изобретения является получение вакцины с низкой реактогенностью и высокой иммунологической эффективностью. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в использовании штамма вируса, обладающего низкой реактогенностью и высокой иммуногенной эффективностью,и применении технологий, позволяющих получать биомассу штамма вакцинного вируса с высоким титром. Способ получения вакцины против инфекционной бурсальной болезни кур,включающий использование штамма -0002 16/1 вируса инфекционной бурсальной болезни кур, продукцию биомассы этих штаммов в развивающихся куриных эмбрионах, свободных от патогенной микрофлоры, стабилизацию защитной средой,содержащей 4 сахарозы,3 гидролизатлактоглобулина и 1 желатина, и сублимационное высушивание с последующим заключением в вакуум. Способ осуществляется следующим образом. Штамм -0002 16/1 вируса инфекционной бурсальной болезни кур, используемый для получения живой сухой вакцины против инфекционной бурсальной болезни кур депонирован в отделе вирусологии ТОО КазНИВИ и обладает следующими свойствами. Штамм-0002 16/1 инфекционной бурсальной болезни кур Репродуктивные свойства. Штамм -0002 16/1 вируса инфекционной бурсальной болезни кур репродуцируется в развивающихся куриных эмбрионах 6-7 суточного возраста, полученных от кур, свободных от патогенной микрофлоры, с развитием патологий в эмбрионе, в котором содержит репродуктивный вирус возбудителя инфекционной бурсальной болезни кур. Репродуктивный титр вируса штамма -0002 16/1 инфекционной бурсальной болезни кур на 45 сутки после инокуляции вируса в тело эмбриона достигает 105,5-106,5 ЭИД 50/см 3. Антигенные свойства. При интраназальном,подкожном и энтеральном введении репродуктивного вируса штамма -0002 16/1 инфекционной бурсальной болезни кур в дозе от 102,0 ЭИД 50/гол в организме птицы 30 суточного возраста на 21 сутки после инокуляции 2 формируются специфические вируснейтрализующие антитела в титрах 1,7-2,2 и преципитирующие в титрах 2-4 2. Патогенные свойства. Репродуктивный вирус штамма -0002 16/1 инфекционной бурсальной болезни кур является аттенуированным и не обладает патогенными свойствами по отношению к птице. Вирус штамма-0002 16/1 инфекционной бурсальной болезни кур также не патогенен для лабораторных и сельскохозяйственных животных, а также для человека. Иммуногенные свойства. При однократном окулярном и энтеральном введении вируса штамма-0002 16/1 инфекционной бурсальной болезни кур в дозе от 102,0 ЭИД 50/гол в организме птицы от 30 суточного возраста на 21 сутки после инокуляции формируются специфические вируснейтрализующие антитела в титрах 1,7-2,2 ,которые являются показателем напряженного иммунитета. Птица, имеющая антитела в указанных титрах, остается гарантированно защищенной от вирулентного вируса инфекционной бурсальной болезни кур. Иммунитет, сформированный на введение штамма-0002 16/1 вируса инфекционной бурсальной болезни кур после ревакцинации продолжается в течение всего периода эксплуатации. Безвредность. Штамм -0002 16/1 вируса инфекционной бурсальной болезни кур в дозах до 103,0 ЭИД 50/гол безвреден для кур от 30 суточного возраста при интраназальном, внутримышечном,подкожном и энтеральном методе введения. Реактогенность. Штамм -0002 16/1 вируса инфекционной бурсальной болезни кур в дозе до 103,0 ЭИД 50/гол клинически не реактогенен для кур от 30 суточного возраста при интраназальном,внутримышечном, подкожном и энтеральном методах введения. Реверсибельность. Штамм -0002 16/1 вируса инфекционной бурсальной болезни кур при репродукции последовательными и перемежающимися пассажами в развивающихся куриных эмбрионах и цыплятах не восстанавливает и не приобретает патогенных свойств по отношению к восприимчивой птице. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма -0002 16/1 вируса инфекционной бурсальной болезни кур стабильно сохраняются в течение не менее 10 последовательных пассажей (срок исследования) в развивающихся куриных эмбрионах. Сохраняемость. Штамм -0002 16/1 вируса инфекционной бурсальной болезни кур в лиофильно высушенном состоянии с защитной средой,содержащей 4 сахарозы,3 гидролизатлактоглобулина и 1 желатина, в конечных концентрациях, не снижает свою биологическую активность в течение 5 лет при температуре минус 40 С и ниже, 36 месяцев при температуре минус 20 С, 12 месяцев при температуре 4-8 С. В нативном виде вирус сохраняет свои исходные биологические свойства в течение 12 месяцев при температуре минус 40 С и ниже, 30 суток при температуре 4-8 С. Пример 1. Для получения живой сухой вакцины против инфекционной бурсальной болезни кур готовят биомассу штамма -0002 16/1 вируса инфекционной бурсальной болезни кур путем репродукции в развивающихся куриных эмбрионах. Для этого в последовательных пассажах развивающиеся куриные эмбрионы 6-7 суточного возраста, полученные от кур, свободных от патогенной микрофлоры, заражают вирусом инфекционной бурсальной болезни кур в дозе 103,0 ЭИД 50 на эмбрион. Вирусы вводят в объемной дозе 0,1-0,3 см 3 в аллантоисную полость. Зараженные эмбрионы инкубируют при температуре 37 С влажности воздуха не ниже 50 с периодической сменой положения вокруг оси. Эмбрионы с вирусом инфекционной бурсальной болезни кур инкубируют в течении 96 ч. По истечению срока инкубации эмбрионы овоскопируют,отделяют погибших,живых подвергают охлаждению при температуре 4-8 С в течение 12-24 ч. Охлажденные эмбрионы вскрывают строго соблюдая условия асептики,собирают эмбрионы. Тело эмбриона однократно замораживают при температуре минус 40 С в течение от 12 ч и размораживают при комнатной температуре (2225 С). Затем ее размельчают с помощью гомогенизатора до получения однородной массы с размерами частиц в диаметре не более 0,01-0,05 см,разбавляя фосфатно-буферным раствором с 7,27,4 до 50 концентрации. Гомогенизированную суспензию отделяют от тканевых частиц центрифугированием при 3000 в течение 30 минут. Очищенную надосадочную жидкость гомогената эмбрионов с вирусом инфекционной бурсальной болезни кур стандартизируют по стерильности согласно ГОСТ 28085 и биологической активности путем титрования в развивающихся куриных эмбрионах. При соответствии биомассы по стерильности требованиям ГОСТ 28085 и наличии титра вируса инфекционной бурсальной болезни кур не менее 105,0 ЭИД 50/см 3 в нее вносят антибиотик гентамицина из расчета 50 на 1 дм 3 в равном объемном соотношении добавляют защитную среду,содержащую 8 сахарозы,6 гидролизатлактоглобулина и 2 желатина. Для получения 100 см 3 защитной среды берут навеску сахарозы 8 г, гидролизатлактоглобулина 6 г и желатина 2 г. Каждый компонент растворяют дистиллированной водой в отдельной посуде. В 45 см 3 дистиллированной воды, помещенной в первую колбу, растворяют навеску сахарозы, в таком же объеме дистиллированной воды,помещенной во второй колбе, растворяют навеску гидролизатлактоглобулина,в 10 см 3 дистиллированной воды в третьей посуде растворяют навеску желатина. Посуды с растворами закрывают ватно-марлевой пробкой и стерилизуют автоклавированием при режиме текущего пара в течение 45 минут. В асептических условиях растворы смешивают в одной стерильной емкости,общий объем доводят стерильной дистиллированной водой до 100 см 3 и используют для стабилизации смеси биомасс вируса инфекционной бурсальной болезни кур после охлаждения до температуры не выше 25 С. Стабилизированную биомассу вируса фасуют по 1, 2 и 4 см 3 в специальные флаконы емкостью510 см 3, на горлышки флаконов вставляют резиновые пробки для сублимационной сушки, охлаждают до температуры минус 50 С в течение не менее 12 ч и подвергают сублимационному высушиванию в специальном для этих целей аппарате. По завершению сушки горлышки флаконов с сухой массой закрывают пробками под вакуумом и обкатывают алюминиевыми колпачками. Сублимационно высушенную стабилизированную смесь вируса инфекционной бурсальной болезни кур, после стандартизации иммунобиологических свойств используют в качестве живой сухой вакцины против инфекционной бурсальной болезни птиц. Пример 2. Живую сухую вакцину против инфекционной бурсальной болезни кур стандартизируют по стерильности, безвредности,титру вируса и иммуногенности. Стерильность устанавливают по ГОСТ 28085. Вакцина должна отвечать требованиям стандарта. Безвредность определяют на здоровых цыплятах 25-30 суточного возраста. Для этого готовят среднюю пробу вакцины путем растворения содержимого трех флаконов добавлением стерильной дистиллированной воды в объеме до объема вакцины перед сушкой. Растворенную вакцину во флаконах объединяют в одной емкости и получают среднюю пробу с содержанием концентрированных вирусов инфекционной бурсальной болезни кур. Среднюю пробу растворенной вакцины инокулируют глазной пипеткой 10 цыплятам в дозе по 0,1 см 3 интраназально. За птицей наблюдают в течение 10 суток с регистрацией вероятных патологических изменений в клиническом состоянии. Вакцина считается безвредной, если все 10 цыплят, привитых концентрированной вакциной, останутся живыми и здоровыми в течение всего срока наблюдения. Допускается развитие у отдельных (1-3) цыплят легкого угнетения с понижением аппетита с 3-х суток после вакцинации, которая продолжается не более 1-2 суток с последующим выздоровлением птицы. Результаты испытания безвредности живой сухой вакцины против инфекционной бурсальной болезни кур приведены в таблице 1. Как видно из данных таблицы 1, все 10 цыплят,привитые вакциной в завышенной не менее чем 100 кратной дозе по сравнению с полевой иммунизирующей дозой, в течение всего периода наблюдения оставались живыми и здоровыми. Какие либо патологии общего и местного характера в клиническом состоянии привитых цыплят не были обнаружены. Полученные данные свидетельствуют о том, что вакцина является безвредной для птицы при завышенных дозах. Иммуногенность определяют на здоровых цыплятах 30-60 суточного возраста, не имеющих в организме специфических антител на вирусы ИББ кур. Для этой цели используют 40 цыплят, которых делят на 2 группы по 20 голов. Из средней пробы растворенной вакцины готовят соответствующее разведение на физиологическом растворе хлорида натрия, чтобы в единице объема которого содержалась одна иммунизирующая доза препарата. Если во флаконе содержится 1000 прививных доз,то это количество умножают на цифру 0,10 которая является прививным объемом вакцины. Результат умножения составит цифру (10000,10)100. Исходя из этого объем содержимого одного флакона доводят до 100 см 3 физиологическим раствором хлорида натрия и полученной суспензией иммунизируют цыплят первой и второй групп интраназальным методом, закапывая 0,1 см 3 в носовую щель. Привитых цыплят содержат в течение 21 сутки отдельно от второй группы,которая является контрольной. По истечению указанного времени от всех привитых и контрольных цыплят отбирают кровь, из которой получают сыворотку. Наличие иммунитета у птицы устанавливают по титрам гуморальных факторов иммунитета в сыворотке крови привитой птицы или по устойчивости их к вирулентному вирусу инфекционной бурсальной болезни кур. При установлении устойчивости к вирулентному вирусу цыплят первой и второй групп в количестве по 20 голов заражают вирулентным вирусом инфекционной бурсальной болезни птиц путем инокуляции возбудителя подкожно в дозе по 103,0 ИД 50 (инфекционная доза). За зараженной птицей наблюдают ежедневно, регистрируя заболевших и выживших в течение 14 суток. Вакцина считается иммуногенной, если к завершению периода наблюдения в первой группе останутся здоровыми и живыми не менее 80 цыплят, а в контрольной группе заболевают не менее 80 цыплят инфекционной бурсальной болезнью кур. Результаты испытания иммуногенности живой сухой вакцины контрольным заражением вирулентным вирусом инфекционной бурсальной болезни кур приведены в таблице 2. Как видно из данных таблицы 2, все 20 цыплят первой группы, зараженные вирулентным вирусом инфекционной бурсальной болезни кур, в течение всего периода наблюдения остались здоровыми и живыми. Тогда как среди контрольных отмечены 18 заболевших цыплят. Полученные данные свидетельствуют о достаточной иммуногенной активности живой сухой вакцины против инфекционной бурсальной болезни кур. При оценке напряженности иммунитета по гуморальным факторам иммунитета, в пробах сыворотки крови, собранных от цыплят на 21 сутки после вакцинации,устанавливают титр преципитирующих антител на вирус инфекционной бурсальной болезни кур в реакции преципитации,поставленной в агаровом геле. Вакцина считается иммуногенной, если титр преципитирующих антител на вирус инфекционной бурсальной болезни кур не менее чем 80 проб сыворотки крови выявляются в титре не ниже 3,0 2. Результаты определения иммуногенности по специфическим антителам на вирусы инфекционной бурсальной болезни кур приведены в таблице 3. Как видно из данных таблицы 3, средний титр преципитирующих антител на вирус инфекционной бурсальной болезни кур составил - 3,7 2. Выявленные тиры антител, специфичных вирусу инфекционной бурсальной болезни кур,свидетельствуют о достаточной иммуногенности живой сухой вакцины против инфекционной бурсальной болезни кур. Применение предлагаемого способа получения живой сухой вакцины против инфекционной бурсальной болезни кур позволит наладить производство этой вакцины и обеспечить потребность ветеринарной службы птицеводческих хозяйств в препарате. Использование живой сухой вакцины, произведенной согласно данному способу,позволит эффективно с меньшими затратами предотвращать эпизоотические вспышки инфекционной бурсальной болезни кур. Таблица 1 Результаты оценки клинической реакции цыплят на введение живой сухой вакцины против инфекционной бурсальной болезни кур в неразведенном виде Использованная птица Вид,возраст Цыплята 30 суточные Клиническое состояние птицы Объемная доза не разведенной вакцины, см 3 Таблица 2 Устойчивость цыплят, привитых живой сухой вакциной к вирулентным вирусам инфекционной бурсальной болезни кур Живая сухая вакцина против ИББ Контрольные Таблица 3 Титры антител (2) на вирусы ИББ в сыворотке крови цыплят, собранной 21 сутки после вакцинации живой сухой вакциной Живая сухая вакцина против ИББ Сроки исследования До прививки ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения живой сухой вакцины против инфекционной бурсальной болезни кур,включающий накопление биомассы вируса инфекционной бурсальной болезни кур и стабилизацию защитной средой,а также сублимационное высушивание, отличающийся тем, что в качестве активного иммуногена используют биомассу штамма -0002 16/1 вируса инфекционной бурсальной болезни кур,стабилизируют защитной средой, содержащей в конечной концентрации 4 сахарозы, 3 гидролизатлактоглобулина,1 желатина,и сублимируют во флаконах в объеме по 1,0 см 3 или 2 см 3 или 4 см 3.