Способ производства комплексного удобрения на основе микроорганизмов и стимуляторов роста

МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ культур, в полевых условиях из каштановых почв Северного Казахстана отбирали растения определенного вида (сою) с хорошо развитой корневой системой и наличием активных клубеньков. Выделение фосфатмобилизующих и фунгицидных микроорганизмов проводили из почвы и ризосферы сорго и суданской травы. Штамм-1 депонирован и хранится в коллекции культур РГП Республиканская коллекция микроорганизмов Центральный музей микроорганизмов под регистрационным номером(свидетельство о депонировании от 09.08.13 г.). Штамм-2 депонирован под номером В-364 в коллекции культур ДЕПОЗИТАРИЙ КазНИИ перерабатывающей и пищевой промышленности от 25.08.2011 года. Штамм-1 находится на депонировании. Заявленное изобретение отличается от других ранее предложенных патентов составом консорциума,в состав которого входят микроорганизмы,обладающие высокими азотфиксирующей,фунгицидной и фосфатмобилизирующей активностями. Предложенный способ соответствует и критерию промышленная применимость, поскольку он базируется на использовании доступного сырья,легко осуществим на известном оборудовании,экологически безопасен, а получаемое удобрение может быть широко использовано в сельском хозяйстве.(72) Раманкулов Ерлан Мирхайдарович Балпанов Дархан Серикович Тен Олег Андреевич Сураганова Динара Аскаровна Есенбаева Акмарал Ертугановна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА КОМПЛЕКСНОГО УДОБРЕНИЯ НА ОСНОВЕ МИКРООРГАНИЗМОВ И СТИМУЛЯТОРОВ РОСТА(57) Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для получения биоудобрения на основе микроорганизмов,обладающий комплексом свойств симбиозной азотфиксирующей активностью для сои, свойством мобилизовать фосфор, обладающий фунгицидной активностью против фитопатогенных грибов,вызывающий болезнь корневых гнилей растений. Целью изобретения является получение активных штаммов,обладающих высокими адаптационными возможностями,высокой производительностью образовывать биомассу на питательных средах различного состава. Для выделения микроорганизмов-2, специфичных для кормовых Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно полифункциональному биологическому препарату для кормовых бобовых трав, на основе консорциума живых микроорганизмов,включающих азотфиксирующие,фосфатмобилизующие бактерии,штаммы с фунгицидной активностью и биологически активные вещества - стимуляторы роста. Более подробно изобретение относится к способу предпосевной обработки семян продуктом,содержащим консорциум штаммов-,-2, а также стимулятор роста - янтарная кислота, используемая для введения в состав инокулянтов. Обязательным приемом при культивировании кормовых бобовых культур является проведение предпосевной обработки семян биологическими удобрениями на основе активных штаммов клубеньковых азотфиксирующих бактерий. Применение азотфиксирующих бактерий способствует повышению синтеза у растений белковых веществ гормональной природы(ауксинов,гиббереллинов,цитокининов),антибиотических и антифунгальных веществ. Улучшение фосфорного питания клубеньков один из факторов, влияющих на эффективность азотфиксации. Существуют почвенные микроорганизмы, ферментные системы которых способствуют переводу труднорастворимых фосфатов почвы в подвижные формы, легко доступные для других видов микроорганизмов и растений. Одновременная обработка семян бобовых препаратами на основе клубенькообразующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов позволяет увеличить эффективность азотфиксации и обеспечить растение фосфором в доступной форме. В настоящее время в Казахстане для борьбы с корневыми гнилями бобовых культур преимущественно используются химические препараты на основе ципроконазола, имазалила,тебуконазола, беномила, тирама, флудиоксонила и других антимикотических препаратов. В отличие от химических фунгицидов биологические препараты не проявляют антагонизма к полезным почвенным микроорганизмам,не снижают активность используемых в сельском хозяйстве микробиологических препаратов. Инокуляция семян перед высевом бактериальными препаратами,обладающими фунгицидной активностью позволяет снизить поражение посевов на начальных этапах культивирования. Одним из наиболее распространенных стимуляторов роста растений является янтарная кислота. Использование биологически активных веществ и стимуляторов роста, в частности янтарной кислоты - один из путей повышения урожайности кормовых культур. Янтарная кислота,являющаяся побочным продуктом фармацевтической промышленности, активизирует процессы обмена веществ уже на ранних стадиях развития сельскохозяйственных культур, повышая урожайность растений к климатическим и другим 2 стрессам, позволяет им реализовать свою максимальную продуктивность Андрианова Ю.И.,Кадошникова И.Г., Максютова Н.Н. и др. Янтарная кислота стимулятор роста // В сб. Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве. - Пущино, 1997. .219 -231., Патент РФ 2267924 С 1. Способ стимулирования роста растений Янтарную кислоту используют в виде водного раствора оптимальной концентрации 10-410-7 моль/л. Дальнейшее уменьшение концентрации до 10-8-10-11 моль/л снижает ростостимулирующую способность янтарной кислоты до уровня контрольных опытов. Данный способ принят за прототип Чупахина Г.Н., Романчук А.Ю. Возможный механизм стимулирования ростовых процессов янтарной кислотой. // Теоретические и прикладные аспекты биологии. Калининград, 1999,с.46-51. Использование комплексного удобрения необходимо для повышения урожайности кормовых сельскохозяйственных культур, экономии азотных и фосфорных минеральных удобрений, повышения экологической безопасности сельскохозяйственного производства. Высокоэффективные штаммы агрономических полезных бактерий,иммобилизованные на специально подобранном носителе, способствовуют улучшению обеспечения растений макро- и микроэлементами. Эффективность и стабильность действия подобранного консорциума на сельскохозяйственные культуры будет обеспечена введением в состав удобрения аборигенных штаммов, устойчивых к воздействию окружающей среды. Внедрение разработанной технологии в производство будет способствовать удовлетворению возрастающих потребностей сельского хозяйства в удобрениях для кормовых культур. Авторы венгерских патентов описали получение порошкообразных культур нитрификации (патент Венгрии 143391), культури(патент Венгрии 188434), культур водорослей (патент Венгрии 195068) и снова культур,а также получение культур микроорганизмов(патент Венгрии 207751).депонирован под 00238,под// 1140. Более подробно в патентах Венгрии 188434 и 207751 авторы описали ферментацию, при которой получают смесь депонированных выше микроорганизмов. Согласно патенту Венгрии 213163 авторы дополнили культуру микроорганизмов патента 207751 карбоксиметилцеллюлозой. Авторы патента Венгрии.,.,. и. Применение и действие микроорганизмов,применяемых в указанных способах,ограничиваются тем фактом, что они при различных условиях культивирования, в почвах различного состава, в различных климатических условиях остаются живыми только в течение короткого промежутка времени, окружающая среда и ризосфера различных растений не всегда создает оптимальные условия. Известен также микробиологический препарат Агростим Б, содержащий консорциум штаммови. (см.,например, статью Кирсанова Е.В., Дарюга К.В. и др. Повышение урожайности зернобобовых культур за счет применения препарата Агростим Б, / Вестник Орел ГАУ,- 4.- 2008 г.). Указанный препарат может использоваться как для предпосевной обработки семян, так и для опрыскивания почвы и вегетирующих растений. Он обладает ростостимулирующим и подавляющим вредную микрофлору действием. Недостатком является то,что при обработке указанным препаратом на корнях растений не происходит образование клубеньков,фиксирующих необходимый для питания растений атмосферный азот, что не позволяет сильно повысить урожайность сои и приводит к необходимости вводить в почву дополнительно азотистые удобрения. Известно также микробиологическое удобрение под сою Ризоторфин на основе штамма клубеньковых бактерий сои 629 а, описанный в материалах к А.с. 939547(приоритет от 05.01.1981 г., опубликовано 30.06.1982 г.), позволяющее получать урожай сои с повышенным содержанием белка в зерне. Указанный штамм 629 а (87) пригоден для промышленного изготовления препаратов клубеньковых бактерий(Ризоторфина). Недостатком является относительно невысокая эффективность на основных производственных сортах сои, выращиваемой на почвах Дальнего Востока. Целью изобретения является получение комплексного биоудобрения,обладающего азотфиксирующей активностью для сои,фунгицидными свойствами против корневых гнилей и фосфатмобилизирующей способностью для улучшения фосфорного питания на основе консорциума микроорганизмов-2,-1,-, соответственно, с целью повышения урожайности сои. Для выделения микроорганизмов-2, специфичных для кормовых культур, в полевых условиях из каштановых почв Северного Казахстана отбирали растения определенного вида (сою) с хорошо развитой корневой системой и наличием активных клубеньков. Выделение фосфатмобилизующих и фунгицидных микроорганизмов проводили из почвы и ризосферы сорго и суданской травы. Культурально-морфологические признаки выделенных штаммов. Микроорганизмы рода-2 представляют собой мелкие удлиненные подвижные палочки размером (2,3-2,5)х 0,5 с закругленными краями, расположенные в мазке хаотично. Хорошо растут на маннитно-дрожжевом агаре (МДА), гороховой среде с глюкозой или сахарозой и на среде 79 (сахароза - 10,00,1 2 НРО 4 - 0,5 472 - 0,2 ЭКД - 1,0 СаСО 3 - 0,2 агар - 20,0 вода водопроводная - до 1 л). Культура медленнорастущая. В качестве единственного источника углерода штамм способен использовать с образованием кислоты арабинозу,ксилозу, глюкозу, галактозу и фруктозу. Клетки-1 прямые палочковидные клетки с закругленными концами,размером 1,9-0,5 мкм, расположенные одиночно попарно или в виде цепочки. Образуют сферические эндоспоры. Через 18 ч роста при (281 С) на мясопептонном агаре (МПА) или картофельноглюкозном агаре клетки образуют колонии грязнобелого цвета. Не выделяют пигменты в питательную среду. Культура ферментирует глюкозу, арабинозу,ксилозу, мальтозу, лактозу, маннит, сахарозу с образованием кислоты без газа. Гидролизует крахмал, желатину, не гидролизует мочевину,утилизирует цитрат. Каталазоположительный. При микроскопировании штамм-1 - хорошо развитый мицелий,образованный базофильными грифами. Актиномицет. Споры неподвижные. На среде РФ-1 колонии круглые, диаметром 3-5 мм, непрозрачные,лимонно-желтые, складчатость радиальная, профиль кратерообразный,край колоний волнистый,консистенция плотная,воздушный мицелий отсутствует, субстратный мицелий прорастает в толщу агара. Штамм-1 депонирован и хранится в коллекции культур РГП Республиканская коллекция микроорганизмов Центральный музей микроорганизмов под регистрационным номером(свидетельство о депонировании от 09.08.13 г.). Штамм-2 депонирован под номером В-364 в коллекции культур ДЕПОЗИТАРИЙ КазНИИ перерабатывающей и пищевой промышленности от 25.08.2011 года. Штамм-1 находится на депонировании. Культивирование клубеньковых азотфиксирующих микроорганизмов-2 для удобрения под сою. Получение рабочей партии культуры-2 проводили на агаризованной минерально-растительнай среде(МРС) следующего состава (г/л) глюкоза - 20,0 Н 2 Р 4 - 0,5 4 - 0,1- 0,2 2 НР 4 - 0,5 24 - 0,1 агар - 20,0 молибдат аммония - 0,5 мл 0,02 раствора соевый отвар - до 1 л. Для получения соевого отвара 10 г муки из сухих пророщенных семян сои кипятили в 1 л водопроводной воды в течение 30 минут полученный отвар процеживали через ватномарлевый фильтр, доводили водопроводной водой до 1 л.среды 6,4-6,7 или 6,8-7,0 в зависимости от культуры микроорганизмов. Получение маточной культуры на колбах проводили на жидкая маннитно-дрожжевой среде следующего состава 3(МДС, г/л) 2 НРО 4 - 0,5 маннит - 10,0 сульфат магния семиводный- 0,2 натрий хлористый - 0,1 ЭКД - 2,0 вода водопроводная - до 1 л. Отдельно,растворяют маннит, затем добавляют расчетные количества сульфата магния семиводного, хлорида натрия, фосфат калия однозамещенного и экстракт кормовых дрожжей. Кипятят на слабом огне при постоянном перемешивании до полного растворения ингредиентов, затем доводят объем раствора до 1 л.среды 6,8-7,2. Получение посевного материала проводили в инокуляторе микроорганизмов-2 рабочей культуры, выращенной в колбах на соответствующих средах в объеме 200-300 мл. Получение биомассы культур-2 в ферментере проводили на питательной среде МДС. К ферментеру со стерильной питательной средой,глюкозой стерильно подсоединяют инокулятор с посевной культурой. Засев производят передачей посевной культуры из инокулятора в количестве 5-8 от объема питательной среды в ферментере путем создания избыточного давления (0,70,1 кг/см 2) в инокуляторе. Процесс культивирования проводят при постоянном перемешивании,скорость вращения мешалки составляет (40020) об/мин. Поддержание газообмена культуры осуществляют при помощи аэрации стерильным воздухом, расход воздуха составляет 0,5 л/мин/1 л среды (до 4 часов роста) и 1 л/мин /1 л среды (после 4 часов роста). Полученную культуральную жидкость подвергают концентрированию на центробежной центрифуге с дальнейшим проведением распылительной сушки. Титр микроорганизмов должен составлять не менее 11010 КОЕ/г. Культура должна быть подвижная. Культивирование фосфатмобилизирующих микрооганизмов-1 проводили на пептонной питательной среде следующего состава (г/л) пептон - 10,0 472 - 0,5- 3,0 глюкоза - 5,0 вода водопроводная - до 1 лсреды 6,8- 7,2, режим стерилизации - (1211)С, в течение 30 минут. Условия проведения ферментации при температуре(322)С,продолжительности процесса - 56 часов, скорость вращения мешалки - 150-200 об/мин, воздухообмен- 7 л/мин и давлении - 0,02-0,04 МПа. Полученную культуральную жидкость подвергают концентрированию на центробежной центрифуге с дальнейшим проведением распылительной сушки. Титр микроорганизмов должен составлять не менее титр клеток составил не менее 5,0109 КОЕ/г. Культивирование фунгицидных микроорганизмов-1 проводили на питательной среде следующего состава, г/л рыбная мука - 10,0 пептон - 5,0 крахмал - 10,0 лактоза - 20,0- 5,0 (4)24 2,0 СаСО 3 - 5,0 вода питьевая - до 1 л. Питательную среду готовили и стерилизовали в ферментере. О ходе процесса культивирования судили по накоплению биомассы продуцента,усилению ее желтизны, изменению , полноте потребления источников углерода,4 микроскопическому строению продуцента. Оптимальные условия проведения ферментации температура - (302)С скорость вращения мешалки - 450 мин-1 расход воздуха на аэрацию 10 л/мин (первые 24 ч ферментации), 20 л/мин (далее до окончания процесса культивирования) избыточное давление - 0,02-0,03 МПа время культивирования - 72-96 ч,6,8-7,2. Полученную культуральную жидкость распыляют на распылительной установке и получают биомассу,проявившую высокую фунгицидную активность. Способ можно проиллюстрировать следующими примером. Пример 1. Получение комплексного биоудобрения. Культуры-1,-2,-1 в соотношении 111, добавляют сухой каолин в соотношении консорциум микроорганизмовкаолин (110), компоненты гомогенизируют на электрической мельнице, в течение 2 мин. Гомогенизированный препарат пересыпают в металлическую емкость и при помощи мерного стакана наполняют полиэтиленовый пакет, по массе до (50010) г,контроль осуществляют на весах торговых. Необходимое количество препарата смешивают с водой в соотношении 110 и в качестве стимулятора роста добавляют янтарную кислоту концентрацией 10-7 моль/л, после чего подготовленный раствор используют для инокуляции семян сои из расчета 1 л готового раствора на 100-120 кг семян. Высев семян сои осуществляют не позднее, чем через 24 часа после инокуляции. Пример 2. Оценка синергического действия биологически активных микроорганизмов. В лабораторных условиях был поставлен эксперимент по определению совместного влияния-1 ина биологическую активность азотфиксирующих микроорганизмов-2,образующих клубеньки на корнях сои. Предварительно простерилизованные семена сои инокулировали смесью культуральных жидкостей в следующих вариантах 1) смесь КЖ инфицирование. 15) смесь КЖ . -1,-1 и-2 в соотношении 111 16) контроль (без инокуляции и инфицирования). Инокулированные семена высевали на поверхность агаризованной питательной среды для растений (по одному семени в пробирку). Семена проращивали в темном месте при комнатной температуре,в дальнейшем инкубация осуществлялась при комнатной температуре и искусственном освещении (соотношение дневных и ночных часов 16 и 8 соответственно). Через 7 суток культивирования провели оценку роста и развития растений. В вариантах эксперимента с инфицированием.,.,, а также в случае инокулирования семян смесью., растения не развивались. На поверхности питательной среды и семян образовался мицелий гриба, при этом в пробирках с внесением., мицелий имеет типичный красноватый оттенок, в пробирках с внесением., мицелий белый, характерный для представителей грибов этого семейства. Рост растений в указанных вариантах остановился на стадии семени либо образования первых двух листьев. В вариантах, включающих инокулирование-2 (1, 5,6,7,8,9, 10,11,15) в течение 10-11 суток развитие растений проходило без особенностей, на 12-13 сутки отмечены характерные изгибы боковых корней в местах будущего образования клубеньков. Клубеньки образовались через 21 сутки после постановки эксперимента, диаметр клубеньков 0,7-1 мм, количество - 5-6 на 1 растении. В лабораторных условиях не было отмечено значительных изменений в росте и развитии растений при использовании в составе инокулирующей смеси янтарной кислоты. В результате эксперимента было показано, что фунгицидный микроорганизм-1 угнетающе влияет на рост и размножение фитопатогенных грибков., .,, препятствуя заражению корневой системы растений, однако не задерживает размножение микроорганизмов-2 и образование клубеньков на корнях растений сои. Фосфатмобилизующий микроорганизм-1 также не подавляет активность клубенькообразующих микроорганизмов-2. Полученные результаты показывают, что микроорганизмы-1 и-1 могут быть использованы в составе комплексных биологических удобрений. Фунгицидный микроорганизм-1 оказывает действие на фитопатогены как на поверхности питательной среды, так и на поверхности семян, зараженных возбудителями грибковых инфекций. В то же время при совместной инокулаяции-1 не препятствует проявлению биологической активности бактериальных хозяйственно-полезных культур. Таким образом, предлагаемый способ получения комплексного препарата имеет ряд преимуществ- препараты на основе композиций нескольких микроорганизмов характеризуются большей эффективностью по сравнению с монокомпонентными при использовании в различных агроклиматических условиях- комплексное действие микроорганизмов приведет к нормализации ризосферной микрофлоры, увеличению интенсивности роста и повышению урожайности- стимулятор роста в составе комплексного препарата будет способствовать активному размножению микроорганизмов и росту растений,входящих в состав удобрения внесение препарата возможно путем инокуляции семян, что снижает потери препарата. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ производства комплексного удобрения,включащий использование микроорганизмов,иммобилизацию биомассы на органическом носителе, отличающийся тем, что используют консорциум микроорганизмов-1,-2 и дополнительно включают стимулятор роста, в качестве которого используют янтарную кислоту.