Биологический способ стимуляции роста и защиты растений сахарной свеклы от фитопатогенных микроорганизмов

(51) 01 63/00 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ культуральную жидкость ассоциации вносят гумат натрия и семь микроэлементов. Ассоциация бактерий обладает способностью к повышению всхожести семян растений сахарной свеклы и дальнейшей стимуляции их роста и развития, а также широким спектром антагонистической активности по отношению к фитопатогенным микроорганизмам,вызывающим заболевания растений. Применение данного способа позволяет повысить всхожесть растений сахарной свеклы на 810, активно стимулировать рост и развитие ее проростков, что выражается в увеличение средней длины стебля и корня по сравнению с контролем,позволяет эффективно защищать растения от фитопатогенных микроорганизмов,таких, .. - , .. , . , вызывающих пораженность растений сахарной свеклы и приводит к повышению урожая в среднем на 34,0 ц/га по сравнению с контролем и на 24,0 ц/га по сравнению с эталоном. Использование данного способа экологически безопасно и соответствует требованиям охраны окружающей среды, поскольку основано на естественном взаимодействии организмов в природе, не приводит к загрязнению почвы и нарушению биологического равновесия, так как целлюлолитические бактерии являются полезными представителями микрофлоры почвы, которые участвуют в процессе почвообразования.(72) Саданов Аманкелди Курбанович Смирнова Ирина Эльевна Муи булы длхан Кузнецова Татьяна Валерьевна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) БИОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА И ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ(57) Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к растениеводству, и может быть использовано для стимуляции роста и защиты растений от болезней, вызываемых фитопатогенных микроорганизмов. Способ биологической стимуляции роста и защиты растений сахарной свеклы от фитопатогенных микроорганизмов включает предпосевную обработку семян ассоциацией целлюлолитических бактерий, отличающийся тем,что для создания ассоциации используют штаммы целлюлолитических бактерийИМВ В-52 иИМВ-46 в соотношении 12. Также отличающийся тем, что для повышения биологической активности штаммов бактерий в Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к растениеводству, и может быть использовано для стимуляции роста и защиты растений от болезней, вызываемых фитопатогенных микроорганизмов. Основной ущерб сельскохозяйственным культурам причиняется вирусными,бактериальными и грибными патогенами. Первое место по вредоносности среди возбудителей заболеваний растений занимают грибные фитопатогены. Так, эффективное возделывание сахарной свеклы ограничивается такими болезнями как фузариозы, корневые гнили, церкоспороз,мучнистая росой, пероноспороз и др. Наиболее эффективным и экологически чистым методом защиты растений от фитопатогенов является использование микроорганизмов, которые могут быть антагонистами фитопатогенных грибов и бактерий. Известен способ защиты растений с использованием ассоциации штаммов бактерийК-4,-12,30-40,обладающей противогрибковыми и ростостимулирующими свойствами (Патент РФ 2005124138, А 01 63/02,С 12 1/20, 2007). Недостатком этого способа является то, что ассоциация характеризуется небольшим спектром антагонистического действия по отношению к фитопатогенным микроорганизмам. Кроме того, в ассоциацию дополнительно вносят наполнители, такие как каолин, соевую муку, источники микроэлементов,витамины, гидролизат смеси хвойного экстракта и хлорофиллкаротиновую пасту, что значительно удорожает применение способа. Наиболее близким прототипом является способ биологической защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных грибов, основанный на использовании ассоциации штаммов целлюлолитических бактерийВКПМ В-4441 иВКПМ В-4465(Инновационный патент РК 24974, 01 63/00,С 12 1/20, С 12 1 39, 2011). Недостатком этого способа является то,что ассоциация микроорганизмов не оказывает стимулирующего влияния на растения сахарной свеклы и не обладает антагонистическими свойствами по отношению к фитопатогенным микроорганизмам, вызывающим заболевания сахарной свеклы. Задачей изобретения является разработка эффективного и экономичного биологического способа защиты растений сахарной свеклы от фитопатогенных микроорганизмов, вызывающих такие заболевания как корнеед, фузариозные гнили и другие. Задача решается путем использования для предпосевной обработки семян сахарной свеклы ассоциации целлюлолитических бактерийИМВ В-52 иИМВ В-46 с высокой антагонистической активностью и широким спектром действия по отношению к фитопатогенным микроорганизмам,а также стимулирующей рост растений сахарной свеклы за 2 счет синтеза биологически активных метаболитов. Штаммы бактерийиИМВ В-46, входящие в состав ассоциации,депонированы в коллекции РГП Институт микробиологии и вирусологии КН МОН РК под номерамиИМВ В-52 иИМВ В - 46. Копии справок о депонировании штаммов прилагаются. Для повышения биологической активности штаммов ассоциации дополнительно вносят такие вещества как гумат натрия и семь микроэлементов. Характеристика штаммаИМВ В-52 Штамм выделен из разлагающейся древесины с последующей селекцией активного варианта на жидких и твердых средах. Грамположительные палочки 2,50,5 - 5,00,8 мкм, располагаются поодиночке, парами и короткими цепочками. Перетрих. Центральнорасположенные овальные споры 0,50,8 мкм в диаметре,форма клеток при спорообразовании не изменяется. Колонии белые или светло-серые, от гомогенных до зернистых. Край приподнятый. Факультативный анаэроб. Растет в широком диапазоне значений(4,0-9,0),лучше в нейтральном, хорошо развивается и в кислой среде. Температура роста от 15 до 45 С и выше, с оптимумом 28-30 С. Споры термостойки. Штамм не токсичен и непатогенен для человека и животных. Рост на синтетических средах хороший. Рост на МПА колонии округлые, поверхность складчатая, край волнистый или лопастной. Цвет колонии белый или светло-серый, колонии непрозрачные, пигмент в среду не выделяется. Структура колоний от гомогенной до зернистой,консистенция тестообразная. Физиолого-биохимические признаки Использует следующие углеводы глюкозу,декстрозу, мальтозу, фруктозу с образованием кислот, а также арабинозу, галактозу, ксилозу,лактозу, сахарозу, маннит с подщелачиванием среды. Крахмал гидролизует, аммиак образует, индол,сероводород не образует. Желатину разжижает. Нитраты восстанавливает до нитритов. Дает положительную реакцию на каталазу. Вызывает подщелачивание и протеолиз молока. Растет на синтетических средах, используя в качестве источника азота нитраты, нитриты,аммонийные соли, не требует внесения в среду витаминов или других факторов роста. Хорошо растет на белковых формах азота и пептоне. Может расти на безазотистых средах,фиксируя молекулярный азот атмосферы. Штамм синтезирует целлюлолитические ферменты эндо-1,4 -глюканазу - 6-7 ед/г,целлобиазу - 34-36 ед/г. Активность целлюлаз определяют по образованию редуцирующих сахаров под действием ферментов на целлюлозосодержащие субстраты модифицированным методом Шомоди-Нельсона Культуру выращивают и хранят на косяках с 0,7 соломенного агара. Температура хранения 5 С, пересев через 3 месяца. Для культивирования штамма используют среды МПА или Гетчинсона. Состав среды Гетчинсона (г) К 2 НР 4-1,0 СаС 2-0,1 4-0,3 3-2,5 -0,1 3-0,01 глюкоза-10 дрожжевой экстракт-1,0 вода водопр.1 л. Температура 28-30 С, время культивирования 24 ч. Характеристика штаммаИМВ В-46 ШтаммИМВ В-46 получен путем выделения из разлагающейся древесины с последующей селекцией на жидких и твердых средах. Мелкие подвижные палочки 1,70,4 мкм, 1-6 полярных жгутика,грамположительные,неспороносные. На плотных средах (МПА, среда Гетчинсона, соломенный агар) колонии желтого цвета, гладкие, блестящие, выпуклые, с хорошим ростом, субстрат не окрашивается. Факультативный анаэроб. Растет в широких пределах значенийот 3,5 до 8,5 (оптимум 6,0). Температурный диапазон роста 12-47 С(оптимум 28-30 С). Штамм не токсичен и не патогенен. Рост на синтетических средах хороший. Рост на МПА колонии круглые с ровным краем,1-2 мм в диаметре, гладкие, блестящие,пастообразной консистенции, желтого цвета. Способность к эмульгированию - равномерная суспензия в воде. Физиолого-биохимические признаки Использует следующие углеводы арабинозу,глюкозу, декстрозу, мальтозу, галактозу, ксилозу лактозу, фруктозу с образованием кислот, маннит,сахарозу с подщелачиванием среды. Энергично разлагает целлюлозу. Крахмал гидролизует, аммиак, индол и сероводород образует. Желатину разжижает, молоко подкисляет. Нитраты восстанавливает до нитритов. Дает положительную реакцию на каталазу. Растет на синтетической среде, используя в качестве источника азота минеральные соли, не требует внесения в среду готовых витаминов или других факторов роста. Штамм синтезирует целлюлолитические ферменты эндо-1,4 глюканазу - 4-6 ед/г,целлобиазу - 30 ед/г. Активность целлюлаз бактерий определяют по образованию редуцирующих сахаров при действии ферментов на целлюлозосодержащие субстраты модифицированным методом Шомоди-Нельсона(Клесов и др., 1980). Культуру выращивают и хранят на косяках с 0,7 соломенного агара. Температура хранения 5 С, пересев через 3 месяца. Для культивирования штамма используют среды МПА или Гетчинсона. Состав среды Гетчинсона (г) К 2 НР 4 - 1,0 СаС 20,1, 4 -0,3, 3 - 2,5,- 0,1, 2 -0,01,глюкоза - 10, дрожжевой экстракт - 1,0, вода водопр. Сущность изобретения поясняется следующим конкретным примером. Пример 1. ШтаммИМВ В-52 иИМВ В-46 выращивают отдельно на среде Гетчинсона (состав среды приведен выше) с пшеничной соломой в качестве источника целлюлозы на качалке при 28-30 С и 180200 об/мин до концентрации 1106 -1108 кл/мл. Полученные жидкие культуры бактерий смешивают в соотношении 12 (В.ИМВ В-52 - 1 часть и С.ИМВ В-46 - 2 части) для создания ассоциации. Для повышения биологической активности штаммов в культуральную жидкость ассоциации бактерий вносят гумат натрия и семь микроэлементов в количестве 0,5 г на 1 л культуральной суспензии бактерий. Пример 2. Для исследования стимуляции роста растений семена сахарной свеклы выдерживают в жидкой культуре ассоциации бактерий с добавками,как указано в примере 1, в течение 6-8 ч при комнатной температуре. Обработанные семена высевают в течение 10-30 ч, оберегая от высыхания. В контроле семена замачивают в водопроводной воде. Затем раскладывают на чашки Петри с агаризованной средой Ковровцева и оставляют для проращивания при комнатной температуре. Через 7 суток проводят подсчет проростков растений,измерение надземной части и корней. Длина проростков обработанных семян превышала длину проростков в контроле. Всхожесть семян также возросла по сравнению с контролем в среднем на 810(табл.1). Разница между результатами опыта и контроля достоверна с вероятностью р 0,05. Пример 3. Антагонистическую активность ассоциации определяют по зонам угнетения роста фитопатогенных грибов. Тест-культуры фитопатогенных микроорганизмов засевают глубинным способом на среду Чапека-7 для грибов,охлажденной до 38-40 С и разливают в чашки Петри. После застывания агара из среды вырезают блоки. В полученные лунки заливают суспензию клеток ассоциации с концентрацией 106 кл/мл из расчета 0,2 мл в каждую лунку. Чашки инкубируют при температуре 28-30 С в термостате в течение шести и более суток. Учет результатов проводят по величине зон подавления роста тест- культур. Полученные данные свидетельствуют о высокой антагонистической активности ассоциации в отношении фитопатогенных микроорганизмов ., .., .. , . , вызывающих поражения растений свеклы (табл. 2). Разница между результатами опыта и контроля достоверна с вероятностью р 0,05. Пример 4. Целлюлолитические бактерии для создания ассоциации выращивают как в примере 1. Семена сахарной свеклы перед посевом обрабатывают водной суспензией ассоциации бактерий (титр 1105-1106 кл/мл) из расчета 50 мл суспензии на 1 кг семян с увлажнением, расход воды 1 л/кг. Обработанные семена высевают в полевых условиях (Алматинская область) порционной 3(0,4 л/га), контролем - необработанные семена. Химические препараты ТМТД и Скор зарегистрированы и рекомендованы для защиты семян от семенных и почвенных инфекций в Республике Казахстан. Полевые опыты показывают, что обработка семян сахарной свеклы ассоциацией целлюлолитических бактерий,значительно повышает всхожесть семян, понижает пораженность фитопатогенами всходов в 2,0-2,4 раза, корнеплодов в 2,1-3,1 раза по сравнению с контролем. При этом урожайность свеклы повышается на 34,0 ц/га по сравнению с контролем и на 24,0 ц/га по сравнению с эталоном (таблица 3). Таким образом, предложенный биологический способ стимуляции роста и защиты растений сахарной свеклы, основанный на использование ассоциации целлюлолитических бактерий В.ИМВ В-52 и С.ИМВ В- 46,положительно влияет на рост и развитие растений сахарной свеклы, эффективно защищает их от фитопатогенных микроорганизмов, вызывающих пораженность растений сахарной свеклы и приводит к повышению урожая в среднем на 34,0 ц/га по сравнению с контролем и на 24,0 ц/га по сравнению с эталоном. Применение данного способа экологически безопасно и соответствует требованиям охраны окружающей среды, поскольку основано на естественном взаимодействии организмов в природе, не приводит к загрязнению почвы и нарушению биологического равновесия, так как целлюлолитические бактерии являются полезными представителями микрофлоры почвы, которые участвуют в процессе почвообразования. Производство биомассы целлюлолитических бактерий для практического применения может быть налажено в любой микробиологической лаборатории на основе простых и дешевых сред,содержащих в качестве источника углерода пшеничную солому, и не требует использования витаминов и других факторов роста. Способность штамма к спорообразованию обеспечивает его сохранность на длительный период времени как в виде активного биопрепарата, так и в природе в составе микробиоты почвы, что улучшает ее плодородие и в последующие после внесения биопрепарата годы. Таблица 1 Стимулирующее влияние ассоциации целлюлолитических бактерий на всхожесть семян и развитие растений сахарной свеклы Варианты опыта Ассоциация Прототип Контроль Спектр антагонистической активности ассоциации в отношении фитопатогенных грибов Тест культуры Зоны подавления роста тест-культур, мм Прототип Ассоциация бактерий 522,3 482,2 17 0,6 19 0,8 321,4 341,7 200,7 230,9 Таблица 3 Влияние обработки семян сахарной свеклы ассоциацией бактерий на всхожесть, пораженность проростков и урожайность растений Ассоциация бактерий ТМТДСкор Поражено,корнеедом болезнями корнеплодов 17,3 7,2 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Биологический способ стимуляции роста и защиты растений сахарной свеклы от фитопатогенных микроорганизмов , включающий обработку семян ассоциацией бактерий,выращенных на среде Гетчинсона с пшеничной соломой при температуре 28-30 С с перемешиванием до концентрации 110 6 1108 кл/мл,отличающийся тем, что используют штаммы целлюлолитических бактерий ИМиВ В-52 иИМиВ В-46 в соотношении 12, в культуральную жидкость ассоциации вносят гумат натрия и семь микроэлементов в количестве 0,5 г на 1 л культуральной суспензии бактерий,семена сахарной свеклы перед посевом обрабатывают водной суспензией ас социации целлюлолитических бактерий из расчета 50 мл суспензии (титр 1105 1106 кл/мл) на 1 кг семян с увлажнением, расход воды 1 л/кг и высевают в течение 10-30 ч, оберегая от высыхания