Способ получения препарата для диагностики ценуроза

(51) 01 33/569 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ препарата для серологической диагностики ценуроза животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в получении более активного препарата для диагностики ценуроза,адаптированного к использованию в ИФА. Способ получения препарата для диагностики ценуроза, включающий отбор эхинококковых цист,выделение сколексов, их гидролиз пепсином,центрифугирование, с последующим отделением центрифугата, осаждение антигена спиртом,ресуспендирование в дистиллированной воде и получение целевого продукта, при этом полученным ценурозным антигеном, дополнительно содержащем экстрат антигена из герминативной оболочки эхинококковых цист, осуществляют иммунизацию продуцентов, получают антисыворотку, выделяют ценурозные антитела, иммунизируют ими другую группу животных-продуцентов,получают сыворотку и методом иммуносорбции выделяют антиидиотипические антитела.(72) Шабдарбаева Гульнар Сабыровна Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Балгимбаева Айжан Ильясовна Хусаинов Дамир Микдатович Амиргалиева Светлана Садуахасовна Турганбаева Гульнар Елдесбаевна Ахметова Гульнази Даулетхановна Усмангалиева Сымбат Суттибаевна Асылханов Дархан Уалиевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Казахский национальный аграрный университет Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Предварительный патент РК 19188, 01 33/569, 2008 г(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЦЕНУРОЗА Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, в частности к способу получения препарата для серологической диагностики ценуроза животных. Известен способ получения препарата для диагностики ценуроза, путем ультразвуковой обработки паразитарной массы и сбором активной фазы, включающий выделение зрелых члеников цестоды, их разрушение,выделение онкосфер,их культивирование,получение проценурусов, с последующей их обработкой ультразвуком при 20-24 кГц в течение 10-15 минут,установкой рН 8,0-9,0,автоклавирование при 1 атмосфере (120 С) в течение 20-30 мин., охлаждение до температуры 1825 С, центрифугирование при 8-10 тыс. оборотов в минуту со сбором надосадочной жидкости(Предварительный патент РК 19188 Способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при ценурозе, бюл. 3.-14.03.2008. МПК 01 33/569). Недостатком способа является низкая активность препарата при диагностике ценуроза,и невозможность использования в более чувствительных серологических тестах (ИФА). Задачей изобретения является разработка способа получения более активного препарата для диагностики ценуроза,адаптированного к использованию в ИФА. Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в получении более активного препарата для диагностики ценуроза,адаптированного к использованию в ИФА. Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения препарата для диагностики ценуроза,включающим отбор эхинококковых цист, выделение сколексов, их гидролиз пепсином,центрифугирование,с последующим отделением центрифугата, осаждение антигена спиртом ресуспендирование в дистиллированной воде и получение целевого продукта, полученным ценурозным антигеном,дополнительно содержащем экстракт антигена из герминативной оболочки эхинококковых цист,осуществляют иммунизацию продуцентов,получают антисыворотку, выделяют ценурозные антитела, иммунизируют ими другую группу животных-продуцентов, получают сыворотку и методом иммуносорбции выделяют антиидиотипические антитела,при этом,иммунизацию продуцентов осуществляли по схеме 1-й день - антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап, по 0,25 см 3 в каждую, 7-й день - внутримышечно по 0,5 см 3 в 2 точки ягодичных мыши 14-й день внутривенно, иммуносорбцию осуществляли в полиакриламидном геле,выделение гаммаглобулиновой фракции осуществляли путем высаливания 50-ным сульфатом аммония,которую концентрировали в диализных трубках на ПЭГ-600 до содержания белка 10 мг/см 3. Антиидиотипические антитела являются зеркальным отражением специфичности 2 соответствующих антител,могут служить имитатором определенной антигенной детерминанты, и могут быть использованы в целях иммунодиагностики и в качестве вакцинных препаратов. Общепринятая ныне технология получения диагностикумов с использованием антигенов связана с большими методическими трудностями получением большого количества эхинококковых цист,фракционированием полученных антигенов, адсорбцией антисывороток. Поэтому перспективным является получение иммунодиагностических препаратов на основе антиидиотипических антител. При этом небольшое количество полученного высококачественного антигена, достаточное для получения антител к нему,может обеспечить получение иммунодиагностических препаратов на основе антиидиотипических антител, как для индикации антигена, так и для обнаружения антител. Пример получение препарата для диагностики ценуроза Препарат для диагностики ценуроза получают следующим образом. 1 Этап. Техника получения нормального антигена. Из уха здорового кролика берут кровь спиртовоксилоловым методом, добавляют трилон Б (2 мгсм 3), центрифугируют 3-5 - кратно при 3000 об., с отмыванием изотоническим раствором натрия хлорида. Полученные эритроциты лизируют путем добавления пяти объемов дистиллированной воды,3-5 кратным попеременным замораживанием и оттаиванием,с последующей обработкой ультразвуком до получения гомогенной суспензии(при 15-20 КГц в течение 25-30 минут). Строму эритроцитов выделяют путем ультрацентрифугирования эритролизата в рефрижераторной центрифуге при 12000 об., и отмывают от гемоглобина. Строма эмульгировалась в таком количестве физиологического раствора,чтобы 1 см 3 эмульсии содержал строму из 1 см 3 эритроцитов, и использовалась в качестве нормального антигена. 2 Этап. Техника получения ценурозного антигена. Из пораженных ларвальным ценурозом органов животных (овец, свиней или крупного рогатого скота) отбирают эхинококковые цисты. Цисты,изолированные от тканей хозяина, вскрываются,жидкая часть сливается в кювету, получается пузырная жидкость. Далее внутреннюю часть цист соскабливают бранашами пинцета и сколексы вымывают в кювет с помощью 0,9 стерильного раствора натрия хлорида до соотношения 15 получается суспензия сколексов. У отмытых оболочек цист отделяется внутренняя герминативная оболочка - получаются кусочки герминативной оболочки. Оставшаяся часть эхинококковой цисты уничтожается. Кусочки герминативной оболочки подвергают гомогенизации при 5 тыс. об/мин, в течение 35 минут ресуспендируются в 0,9 стерильном растворе натрия хлорида в соотношении 15. На каждый литр приготовленной суспензии герминативной оболочки добавляют 25-30 см 3 1 нормального раствора химически чистой соляной кислоты, 3-5 г пепсина и 10 см 3 толуола, смесь тщательно взбалтывают и доводят рН до 3,0 (1 нормальным раствором соляной кислоты). Полученная смесь сливается в шуттель-аппарат и помещается в термостат, где выдерживается при непрерывном помешивании шутгель-алпаратом и температуре 38-39 С в течение 48-72 часов. Через 1,3, 6, 12, 18 и 24 часа проверяется рН среды и доводится до 3,0 (1- нормальным раствором соляной кислоты). Через 48-72 часа с поверхности гидролизатной жидкости ватным тампоном снимается толуоловая пленка, жидкость при этом взбалтывать нельзя. Далее гидролизат подвергается обработке ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут. Затем гидролизат центрифугируется при 3-5 тыс. оборотов 5-10 минут. Осадок суспендируется в 200 мл дистиллированной воды, подвергается повторной обработке ультразвуком до получения гомогенной суспензии (при 15-20 КГц в течение 25-30 минут). Ультразвуковой лизат фильтруется через ватномарлевый тампон (осадок удаляется). Полученная жидкость, содержащая сколексы представляет собой суспензию. На каждый литр суспензии сколексов добавляют 25-30 см 3 1 нормального раствора химически чистой соляной кислоты, 3-5 г пепсина и 10 см 3 толуола, смесь тщательно взбалтывают и доводят рН до 3,0 (1 нормальным раствором соляной кислоты). Полученная смесь сливается в шуттель-аппарат и помещается в термостат, где выдерживается при непрерывном помешивании шуттель аппаратом и температуре 38-39 С в течение 48-72 часов. Через 1. 3, 6, 12, 18 и 24 часа проверяется рН среды и доводится до 3,0 (-нормальным раствором соляной кислоты). Через 48-72 часа с поверхности гидролизатной жидкости ватным тампоном снимается толуоловая пленка, жидкость при этом взбалтывать нельзя. Далее гидролизат подвергается обработке ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут. Затем гидролизат центрифугируется при 3-5 тыс. оборотов 5-10 минут. Осадок суспендируется в 200 см 3 дистиллированной воды,подвергается повторной обработке ультразвуком до получения гомогенной суспензии (при 15-20 КГц в течение 2530 минут). Ультразвуковой лизат фильтруется через ватно-марлевый тампон (осадок удаляется). Пузырная жидкость подвергается обработке ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут. Ультразвуковой лизат фильтруется через ватномарлевый тампон (осадок удаляется). Полученные фильтраты герминативной оболочки, сколексов и пузырной жидкости смешивается в соотношении 11.1. Из полученной смеси осаждается антиген путем добавления 4 объемов 96 спирта этилового (ректификата) при комнатной температуре. При этом рН среды доводится до 7-7,2 путем добавления 1-нормального раствора химически чистого едкого натрия (в начале 1 мл, затем по каплям), с целью получения лучшего осаждения антигена. Через 20-24 часа выдерживания при температуре 4-6 С, выпавший осадок (антиген) собирается центрифугированием при 3-5 тыс. оборотов в течение 10-15 минут. Надосадочный спирт сливается, а осадок (антиген) в начале с небольшим количеством дистиллированной воды(50 мл) тщательно растирается в сметанообразную массу, а за тем переливается в цилиндр, куда добавляется 950 см 3 дистиллированной воды. Полученная взвесь при помешивании разливается во флаконы или ампулы, закрывается стерильными ватными тампонами и подвергается лиофильной сушке. Ампулы запаиваются, а флаконы закрываются стерильными пробками и обкатываются алюминиевыми колпачками. Полученная взвесь при помешивании разливается во флаконы. Антиген контролируют на стерильность,используя специальные питательные среды(отсутствие бактериального загрязнения и грибковой микрофлоры указывает на чистоту препарата). Активность антигена проверяют титрацией в РСК и РИГА. 3 Этап. Техника получения антисыворотки. Подготовленных для иммунизации кроликов(массой не менее 2,5 кг) иммунизируют ценурозным антигеном по следующей схеме 1-й день антигеном в смеси с равным объемом неполного аяьюванта Фрейнда в подушечки лап кроликов, по 0,25 см 3 в каждую, содержание белка должно быть не менее 5 мг/см 3, 7-й день -внутримышечно по 20 мг белка в 2 точки ягодичных мышц 14-й день внутривенную иммунизацию кроликов по схеме сначала 0,02 мг белка, через 30 минут - 0,2 мг, и еше через 30 минут - 20 мг. Через 21 день данную манипуляцию повторяют. Забор крови начинают с 3-го дня после последней инъекции 1-го блока иммунизации, осуществляют по 40-50 см 3 крови,трехкратно, с интервалом 72 часа. Повторно кровь берут начиная с 3-го дня после внутривенной иммунизации, по той же схеме. Далее цикл иммунизации и крововзятия повторяют. Начиная с 3-го дня после начала иммунизации,контролируют титр преципитирующих антител в реакции количественной преципитации (РКП). При достижении титра антител не ниже 300 м кг/см 3 в РКП у кроликов берут по 40-50 см 3 крови,трехкратно, с интервалом 72 часа, затем делают перерыв до следующего цикла иммунизации. Если титры антител ниже указанных, то также проводят дополнительную внутривенную иммунизацию животных по схеме через 2 день. При достижении титра антител после второго цикла иммунизации не ниже 300 мкг/см в РКП у краников берут по 4050 см крови, трехкратно, с интервалом 72 часа затем делают перерыв до следующего цикла иммунизации. 4 Этап. Сорбция балластных антител. Полученные порции антисывороток кроликов объединяли, и проводили сорбцию ценурозных антител по методу .. . (1969). Процесс сорбции ценурозных антител проводился в два этапа вначале с использованием иммуносорбента,3 приготовленного из нормального кроличьего антигена,которым проводили извлечение балластных антител, а затем с использованием иммуносорбента, приготовленного на основе ценурозного антигена которым извлекали ценурозные антитела. При этом использовали иммуносорбенты с инкорпорированным в гранулы полиакриламидного геля нормальным ценурозным антигеном. Оптическую плотность полученного элюата определяли на спектрофотометре СФ-26 и одновременно подсчитывали количество белка в каждой порции. Впоследствии эти ценурозные антитела использовали для иммунизации другой партии кроликов с целью получения антиидиотипа против ценурозных антител. Выделенные антителаобессоливают диализом,затем концентрируют в диализных трубках против полиэтиленгликоля (ПЭГ - 600) до содержания белка не менее 1,0 мгсм 3 и хранят при - 20 С или лиофильно высушивает. 5 Этап. Техника получения диагностикума. Полученный гамма-глобулин или очищенные на иммуносорбенте антитела (АТ-1) смешивают с ПАФ в соотношении 11 (содержание в 1 см 31 мг гаммаглобулина или 200 мг антител). Этой смесью иммунизируют кроликов, иммунизируют в 1-й день- антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап кроликов, по 0,25 см 3 в каждую. На 7-й день иммунизируют антителами внутримышечно по 0,5 см 3 в 2 точки ягодичных мышц 14-день внутривенную иммунизацию кроликов антителами по схеме сначала 0,02 мг белка, через 30 минут - 0,2 мг, и еще через 30 минут - 20 мг. Через 21 день данную манипуляцию повторяют. На 7-9 день после реиммунизации, при титре антител не менее 200 мкгсм 3, определенным РКП, у кроликов брали кровь из краевой ушной вены спирт-ксилольным методом по 40 см 3, трехкратно, с интервалом 72 часа, и отделяли сыворотку. Иммуносорбент был приготовлен по методике А.Н. Маянского с соавт. (1976) с включением дистиллированной воды в матрицу полиакриламидного геля, который использовали для контроля качества сорбции антител из антиидиотипов. Процесс сорбции антиидиотипических антител проводили по методике.в два этапа. Вначале проводили исключение балластных антител. Для этого 10 мл антисыворотки разводили забуференным физиологическим раствором в соотношении 13, приливали к ней иммуносорбент,приготовленный с включением в матрицу полиакриламидного геля дистиллированной воды,устанавливали на магнитную мешалку на 1 час. По истечении часа содержимое центрифугировали, к надосадку приливали иммуносорбент,приготовленный с включением идиотипа в матрицу полиакриламидного геля, устанавливали опять на 1 час на магнитную мешалку. Затем сорбент промывали 5 раз забуференным физиологическим раствором в центрифуге при 3000 об/мин. Для элюции балластных антител использовали 4 мл 4 лимоннофосфорнокислого буфера (рН 2,6). Элюцию проводили дважды удаляя балластные антитела. По истечении 1 часа сорбции антител на магнитной мешалке, проводили однократное центрифугирование смеси в течение 5 минут при 300 об/мин. Осадок промывали 5 минут при 3000 об/мин. Элюцию проводили дважды и получали из каждых 10 см 3 антисыворотки 5 см 3 антиидиотипических антител. Затем определяли в каждой порции антител оптическую плотность и рассчитывали количество белка, после чего антитела нейтрализовали трис - НС 1 до значения 7,0-7,2. Степень очистки контролировали спектрофотометрически, исследуя промывные воды после десорбции с иммуносорбентом промывных вод, содержащих антиизотипы и антиаллотипы. При показании спектрофотометра 0,01-0,02 сыворотка считается очищенной. Далее путем высаливания 50-ным сульфатом аммония выделили гамма-глобулиновую фракцию,которую концентрировали в диализных трубках на ПЭГ-600 до содержания белка 10 мгмл. Полученную серию препарата расфасовывали в ампулы по 2 см 3 с содержанием белка 10 мг/см 3,подвергали лиофильной сушке и запаивали под вакуумом. 6 Этап. Испытание ценурозного диагноста кума. Полученные антиидиотипические антитела испытывали в качестве диагностикума в серологических реакциях(РИГА,ИФА) с отрицательными и положительными ценурозными сыворотками. При постановке РИГА для насадки антииди атипическим иммуноглобулином использовали эритроциты, приготовленные по методике Вайнбаха. Реакцию ставили с сыворотками крови экпериментально зараженных кроликов(отрицательные) Разведения антиидиотипов были от нативного до 164. Разведение диагностикума от 110 до 1320. В результате опыта было установлено,что диагностикум,приготовленный из антиидиотипов, в РИГА можно использовать в разведении 1160. Для постановки ИФА использовали плашки из полистирола. В реакции использовали положительные и отрицательные ценурозные сыворотки, антиидиотип (антиген) разводили карбонатным буфером с рН 9,0. После внесения исследуемых сывороток плашки сенсибилизировали альбумином,конъюгацию выделенного антиидиотипа с пероксидазой хрена Олайнского биокомбината проводили по методике Р. К.. (1974). В качестве субстрата использовали субстрат, предложенный .(1984). Субстрат готовили из смеси ортофенилен диамина(0,4 мг/см 3) и перекиси водорода (конечная концентрация 0.005) на цитратном буферном растворе, рН 5,0. Для промывания полистароловых плашек использовали 0,01 М фосфатный буфер (рН 7,2) на физиологическом растворе, содержащий 0,5 г/л твин-80. Выбор оптимальных концентраций антиидиотипа для сорбции проводили в разведениях от 110 до 12560. Учет реакции проводили визуально (по интенсивности окраски субстрата в опыте и контроле). В результате опыта было установлено, что оптимальные условия постановки ИФА гаммаглобулин из антиидиотинов в разведении 1200-1400, исследуемая сыворотка 180- 1 160. Исследования, проведенные на поголовье 54 овцах и 38 крупном рогатом скоте из благополучных ферм и 47 овцах и 53 крупном рогатом скоте из неблагополучных хозяйств,позволили установить высокую активность ценурозного диагностикума своевременно диагностировать заболевание. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения препарата для диагностики ценуроза,путем ультразвуковой обработки паразитарной массы и сбором активной фазы,отличающийся тем, что в способе получения препарата для диагностики ценуроза, включающим отбор эхинококковых цист, выделение сколексов, их гидролиз пепсином,центрифугирование,с последующим отделением центрифугата, осаждение антигена спиртом,ресуспендирование в дистиллированной воде и получение целевого продукта, полученным ценурозным антигеном,дополнительно содержащем экстракт антигена из герминативной оболочки эхинококковых цист,осуществляют иммунизацию продуцентов,получают антисыворотку, выделяют ценурозные антитела, иммунизируют ими другую группу животных-продуцентов, получают сыворотку и методом иммуносорбции выделяют антиидиотипические антитела,при этом,иммунизацию продуцентов осуществляли по схеме 1-й день - антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап животного, по 0,25 см 3 в каждую, 7-й день внутримышечно по 0,5 см в 2 точки ягодичных мыши 14-й день внутривенно, иммуносорбцию осуществляли в полпакриламидном геле, выделение гамма-глобулиновой фракции осуществляли путем высаливания 50-ным сульфатом аммония, которую концентрировали в диализных трубках на ПЭГ-600 до содержания белка 10 мг/см 3.