Способ получения антиценурозной сыворотки

(51) 01 33/569 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении активности сыворотки. Способ получения антиценурозной сыворотки,включающий получение антигена и иммунизацию им животных в смеси с адъювантом, при этом антиген содержит спиртовый экстракт сколексов,белков специально обработанной герминативной оболочки ценурозных цист и пузырной жидкости, а в качестве животных используют кроликов, которых иммунизируют по следующей схеме 1-й день антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап, по 0,25 см 3 в каждую, содержание белка должно быть не менее 5 мг/см 3, 7-й день -внутримышечно по 20 мг белка в 2 точки ягодичных мышц 14-й день -внутривенную иммунизацию кроликов по схеме сначала 0,02 мг белка, через 30 минут - 0,2 мг, и еще через 30 минут- 20 мг. Способ получения антиценурозной сыворотки обеспечивает (по сравнению с известным способом) получение более активной сыворотки, что позволяет повысить достоверность серологических реакций.(72) Шабдарбаева Гульнар Сабыровна Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Балгимбаева Айжан Ильясовна Хусаинов Дамир Микдатович Амиргалиева Светлана Садуахасовна Турганбаева Гульнар Елдесбаевна Ахметова Гульнази Даулетхановна Усмангалиева Сымбат Суттибаевна Асылханов Дархан Уалиевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Казахский национальный аграрный университет Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Иммунологическая диагностика в профилактике ценуроза животных и человека в Казахстане. Алма-Ата, Кайнар. 1980, с 18(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИЦЕНУРОЗНОЙ СЫВОРОТКИ(57) Изобретение относится к ветеринарной гельминтологии, иммунологии и биотехнологии, в частности к способу получения иммунной сыворотки, применяемой при серологической диагностике ценуроза. Изобретение относится к ветеринарной гельминтологии, иммунологии и биотехнологии, в частности к способу получения иммунной сыворотки, применяемой при серологической диагностике ценуроза. Известен способ получения антиценурозной сыворотки, включающий получение антигена и иммунизацию им животных в смеси с адъювантом,при этом антиген представляет собой лиофилизированный спиртовый экстракт белка специально обработанной смеси сколексов, в качестве животных продуцентов используют овец, а иммунизацию осуществляют антигеном с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда подкожно. 5-7 кратно, с интервалом 7 дней в дозе 5-10 см 3.(Иммунологическая диагностика в профилактике ценуроза животных и человека в Казахстане(рекомендации). Алма-Ата, Кайнар, 1980, с.18.). Известный способ не позволяет получить активную сыворотку. Задачей изобретения является разработка способа получения более активной антиценурозной сыворотки. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении активности сыворотки. Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения антиценурозной сыворотки, включающем получение антигена и иммунизацию им животных в смеси с адъювантом,антиген дополнительно содержит спиртовый экстракт белков специально обработанной герминативной оболочки ценурозных цист и пузырной жидкости, а в качестве животных используют кроликов, которых иммунизируют по следующей схеме 1-й день - антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап, по 0,25 см 3 в каждую, содержание белка должно быть не менее 5 мг/см 3, 7-й день внутримышечно по 20 мг белка в 2 точки ягодичных мышц 14-й день -внутривенную иммунизацию кроликов по схеме сначала 0,02 мг белка, через 30 минут - 0,2 мг, и еще через 30 минут - 20 мг. Заявленный способ отличается от прототипа тем,что антиген дополнительно содержит спиртовый экстракт белков специально обработанной герминативной оболочки ценурозных цист и пузырной жидкости с установленными режимами гомогенизации, гидролиза и центрифугирования. В качестве продуцентов используют кроликов с установленными сроками иммунизации, дозами и местом введения антигена. Таким образом,заявляемый способ соответствует критерию изобретения новизна. Известное техническое решение, в котором в качестве антигена применялась смесь подвергнутых гидролизу пепсином и воздействию ультразвука сколексов с осаждением белка спиртом,использованием в качестве продуцентов овец с подкожной их иммунизацией не обеспечивало получения достаточно активной сыворотки. Поэтому антиген был дополнительно обогащен спиртовым экстрактом белков специально 2 обработанной герминативной оболочки ценурозных цист и пузырной жидкости, а для повышения активности сыворотки в качестве продуцентов были использованы кролики, отработаны режимы их иммунизации, дозы и место введения антигена. Это позволяет сделать вывод о соответствии критерию существенные отличия. В силу того, что предлагаемый способ предполагает использование лабораторных животных - кроликов, удобных в уходе и содержании, с использованием многоступенчатой вакцинации, специфическая активность получаемых сывороток значительно повышается, что повышает эффективность и результативность диагностических тестов. Пример получение антиценурозной сыворотки Антиценурозную сыворотку получают следующим образом. Из пораженных ларвальным ценурозом органов животных (овец, свиней или крупного рогатого скота) отбирают ценурозные цисты. Цисты,изолированные от тканей хозяина, вскрываются,жидкая часть сливается в кювету, получается пузырная жидкость. Далее внутреннюю часть цист соскабливают бранашами пинцета и сколексы вымывают в кювет с помощью 0,9 стерильного раствора натрия хлорида до соотношения 15 получается суспензия сколексов, У отмытых оболочек цист отделяется внутренняя герминативная оболочка - получаются кусочки герминативной оболочки. Оставшаяся часть ценурозный цисты уничтожается. Кусочки герминативной оболочки подвергают гомогенизации при 5 тыс. об/мин, в течение 3-5 минут и ресуспендируются в 0,9 стерильном растворе натрия хлорида в соотношении 15. На каждый литр приготовленной суспензии герминативной оболочки добавляют 25-30 см 3 1 нормального раствора химически чистой соляной кислоты, 3-5 г пепсина и 10 см 3 толуола, смесь тщательно взбалтывают и доводят рН до 3,0 (1 нормальным раствором соляной кислоты). Полученная смесь сливается в шуттель-аппарат и помещается в термостат, где выдерживается при непрерывном помешивании шуттель-аппаратом и температуре 38-39 С в течение 48-72 часов. Через 1,3, 6, 12, 18 и 24 часа проверяется рН среды и доводится до 3,0 (1 -нормальным раствором соляной кислоты). Через 48-72 часа с поверхности гидролизатной жидкости ватным тампоном снимается толуоловая пленка, жидкость при этом взбалтывать нельзя. Далее гидролизат подвергается обработке ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут. Затем гидролизат центрифугируется при 3-5 тыс. оборотов 5-10 минут. Осадок ресуспендируется в 200 см 3 дистиллированной воды, подвергается повторной обработке ультразвуком до получения гомогенной суспензии (при 15-20 КГц в течение 2530 минут). Ультразвуковой лизат фильтруется через ватно-марлевый тампон (осадок удаляется). Полученная жидкость, содержащая сколексы представляет собой суспензию. На каждый литр суспензии сколексов добавляют 25-30 см 3 1 нормального раствора химически чистой соляной кислоты, 3-5 г пепсина и 10 см 3 толуола, смесь тщательно взбалтывают и доводят рН до 3,0 (1 нормальным раствором соляной кислоты). Полученная смесь сливается в шуттель-аппарат и помещается в термостат, где выдерживается при непрерывном помешивании шуттель-аппаратом и температуре 38-39 С в течение 48-72 часов. Через 1,3, 6, 12, 18 и 24 часа проверяется рН среды и доводится до 3,0 (1-нормальным раствором соляной кислоты). Через 48-72 часа с поверхности гидролизатной жидкости ватным тампоном снимается толуоловая пленка, жидкость при этом взбалтывать нельзя. Далее гидролизат подвергается обработке ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут. Затем гидролизат центрифугируется при 3-5 тыс. оборотов 5-10 минут. Осадок суспендируется в 200 см 3 дистиллированной воды,повторно подвергается обработке ультразвуком до получения гомогенной суспензии (при 15-20 КГц в течение 2530 минут). Ультразвуковой лизат фильтруется через ватно-марлевый тампон (осадок удаляется). Пузырная жидкость подвергается обработке ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут. Ультразвуковой лизат фильтруется через ватномарлевый тампон (осадок удаляется). Полученные фильтраты герминативной оболочки, сколексов и пузырной жидкости смешивается в соотношении 111. Из полученной смеси осаждается антиген путем добавления 4 объемов 96 спирта этилового (ректификата) при комнатной температуре. При этом рН среды доводится до 7-7,2 путем добавления 1-нормального раствора химически чистого едкого натрия (в начале 1 см 3, затем по каплям), с целью получения лучшего осаждения антигена. Через 20-24 часа выдерживания при температуре 4-6 С, выпавший осадок (антиген) собирается центрифугированием при 3-5 тыс. оборотов в течение 10-15 минут. Надосадочный спирт сливается, а осадок (антиген) вначале с небольшим количеством дистиллированной воды (50 мл) тщательно растирается в сметанообразную массу, а затем переливается в цилиндр, куда добавляется 950 мл дистиллированной воды. Полученная взвесь при помешивании разливается во флаконы. Антиген контролируют на стерильность,используя специальные питательные среды(отсутствие бактериального загрязнения и грибковой микрофлоры указывает на чистоту препарата). Активность антигена проверяют титрацией в РСК и РНГА. Подготовленных для иммунизации кроликов(массой не менее 2,5 кг) иммунизируют ценурозным антигеном последующей схеме 1-й день -антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап кроликов, по 0,25 см 3 в каждую, содержание белка должно быть не менее 5 мг/см 3, 7-й день -внутримышечно по 20 мг белка в 2 точки ягодичных мышц 14-й день - внутривенную иммунизацию кроликов по схеме сначала 0,02 мг белка, через 30 минут - 0,2 мг, и еще через 30 минут-20 мг. Через 21 день данную манипуляцию повторяют. Забор крови начинают с 3-го дня после последней инъекции 1-го блока иммунизации,осуществляют по 40-50 мл крови, трехкратно, с интервалом 72 часа. Повторно кровь берут начиная с 3-го дня после внутривенной иммунизации, по той же схеме. Далее цикл иммунизации и крововзятия повторяют. Начиная с 3-го дня после начала иммунизации,контролируют титр преципитируюших антител в реакции количественной преципитации (РКП). При достижении титра антител не ниже 300 мкг/см 3 в РКП у кроликов берут по 40-50 см крови,трехкратно, с интервалом 72 часа, затем делают перерыв до следующего цикла иммунизации. Если титры антител ниже указанных, то также проводят дополнительную внутривенную иммунизацию животных по схеме через 21 день. При достижении титра антител после второго цикла иммунизации не ниже 300 мкг/см 3 в РКП у кроликов берут по 4050 см 3 крови, трехкратно, с интервалом 72 часа,затем делают перерыв до следующего цикла иммунизации. Подтверждение достижения положительного эффекта. Полученные сыворотки апробированы на чувствительность и специфичность в реакции количественной преципитации (РКП), в сравнении с сыворотками, полученными известными ранее способами. Результаты испытаний представлены в таблице 1. Как видно из таблицы, предлагаемый способ в сравнении с известным, позволяет получать диагностические сыворотки с более высокой активностью. Таким образом,способ получения антиценурозной сыворотки обеспечивает (по сравнению с известным способом) получение высокоактивной и высокоспецифичной сыворотки,что позволяет повысить достоверность серологических реакций. Таблица 1 Результаты испытаний активности и специфичности сывороток полученных по предлагаемому способу,в сравнении с известными Способ иммунизации Результаты серологических реакций Количественной преципитации,Реакции связывания комплемента,мг/см 3 Результаты серологических реакций Количественной преципитации,Реакции связывания комплемента,мг/см 3 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антиценурозной сыворотки,включающий получение антигена и иммунизацию им животных в смеси с адьювантом, при этом антиген представляет собой лиофилизированный спиртовый экстракт белка специально обработанной смеси сколексов, отличающийся тем, что антиген дополнительно содержит спиртовый экстракт белков специально обработанной герминативной оболочки ценурозных цист и пузырной жидкости, а в качестве животных используют кроликов, которых иммунизируют по следующей схеме 1-й день антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап животного, по 0,25 см 3 в каждую, содержание белка должно быть не менее 5 мг/см 3, 7-й день -внутримышечно по 20 мг белка в 2 точки ягодичных мышц, 14-й день внутривенную иммунизацию кроликов по схеме сначала 0,02 мг белка, через 30 минут - 0,2 мг, и еще через 30 минут - 20 мг.