Способ прогнозирования тяжести течения ревматоидного артрита

(51) 01 33/48 (2009.01) 01 33/53 (2009.01) 12 1/68 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН Изобретение относится к медицине, в частности к ревматологии и может быть использовано в клинической практике для прогнозирования тяжести течения ревматоидного артрита (РА). Известен способ прогнозирования тяжести течения ревматоидного артрита путем определения в крови уровней провоспалительных цитокинов , -6 и хемокина МСР-1. При достоверном повышении уровня цитокинов -, -6 и хемокина МСР-1 относительно контроля прогнозируют усугубление тяжести течения ревматоидного артрита.(Соколова В.В., Лапин СВ., Москалев А.В.,Мазуров В.И. Клинико-иммунологические взаимосвязи при раннем ревматоидном артрите // Медицинская иммунология - 2007 - 9,6 - с. 635642). Недостатком данного способа является то, что уровень цитокина в кровивариабельный показатель,по которому можно судить лишь об активности заболевания, но не прогнозировать тяжесть течения ревматоидного процесса. Также трудно судить о прогнозе заболевания одномоментно определяя уровень 3-х цитокинов, поскольку их значения и соотношения между собой могут быть разными. По предъявляемому нашему способу определяется стабильный показатель - генотип одного цитокина,например, фактор некроза опухолей, который не(57) Изобретение относится к медицине, в частности к ревматологии и может быть использовано в клинической практике для прогнозирования тяжести течения ревматоидного артрита (РА). Техническим результатом изобретения является повышение точности прогнозирования. Это достигается тем, что в заявляемом способе прогнозирования тяжести течения ревматоидного артрита,включающем исследование крови,проведение молекулярно - генетического анализа,согласно изобретению, определяют генотип гена, и при носительстве АА генотипа прогнозируют неблагоприятную форму течения заболевания. меняется от активности заболевания и может служить прогностическим показателем. Известен также способ прогнозирования тяжести течения ревматоидного артрита путем проведения молекулярно - генетического исследования и определения в крови гена 104. При выявлении у больного ревматоидным артритом аллеля 104 прогнозируют неблагоприятный быстропрогрессирующий характер течения данного заболевания.(Девальд И.В., Ходус Е.А., Суслова Т.А.,Бурмистрова А.Л. Влияние гена 104 на возникновение и течение ревматоидного артрита // Вестник Челябинского государственного университета- 2008,4, с. 21-23,165). Недостатком данного способа является то, что определение антигенов гистосовместимостикласса больше служит для точности диагностики ревматоидного артрита,что является общеизвестным фактом, и не может быть использован для прогнозирования течения заболевания. Задачей изобретения является создание точного и эффективного способа прогнозирования тяжести течения ревматоидного артрита, позволяющего проводить индивидуальную оценку активности процесса для получения возможности подбора адекватной фармакотерапии и снижения риска возникновения осложнений.(72) Омарбекова Жазира Есенгельдиевна Иванова Райфа Латыфовна Святова Гульнара Салаватовна Березина Галина Михайловна(56) Девальд И.В., Ходус Е.А., Суслова Т.А.,Бурмистрова А.Л. Влияниегена 104 на возникновение и течение ревматоидного артрита // Вестник Челябинского государственного университета- 2008,4 - . 21-23, 165(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЯЖЕСТИ ТЕЧЕНИЯ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА 24016 Техническим результатом изобретения является повышение точности прогнозирования. Это достигается тем, что в заявляемом способе прогнозирования тяжести течения ревматоидного артрита,включающем исследование крови,проведение молекулярно - генетического анализа,согласно изобретению, определяют генотип гена,и при носительстве АА генотипа прогнозируют неблагоприятную форму течения заболевания. Способ осуществляется следующим образом. Молекулярно-генетическое исследование проводят в несколько этапов. Выделение ДНК из периферической крови обследуемых проводят на станции выделения ДНК/РНК 6100 фирмысогласно протоколу, прилагаемому к данным реагентам. Для анализа полиморфизма 308 генаиспользуют диагностический набор праймеров и рестриктаз, рассчитанный на анализ 100 образцов ДНК производства ООО Центр молекулярной генетики (г. Москва, Россия) (код набора). Амплификацию ДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением специфичных олигонуклеотидных праймеров проводят на амплификаторе( США) в 23 мкл реакционной смеси. ПЦР проводят по схеме начальная денатурация (95 С,5 мин.) 30 циклов амплификации со следующими параметрами 1) денатурация - 94 С, 1 сек 2) отжиг - 66 С, 1 сек 3) синтез - 72 С, 1 сек после чего проводят инкубацию при 72 С в течение 7 минут. Амплифицированные фрагменты подвергают ферментативному гидролизу с использованием фермента рестрикции, который способствует выпадению сайта рестрикции при наличии мутации. В 3 мкл рестрикционной смеси добавляют 12 мкл амплификата. Полученную смесь после центрифугирования подвергают термостатированию при 37 в течение ночи. Полученные гидролизаты оценивают путем проведения вертикального электрофореза в 7-ном полиакриламидном геле(ПАА) при напряжении поля 160 В/см в течение 5060 мин. В качестве электрофорезного буфера используют однократный трис-боратный буфер(1). В качестве маркера используют образцы амплифицированной ДНК до рестрикции и маркер молекулярного веса 100 .р. По окончании электрофореза гель окрашивают бромистым этидием (0,1 мкг/мл) в течение 10-15 минут и визуализируют в проходящем ультрафиолетовом свете. Детекцию результатов электрофореза проводят с использованием Системы документации гелей -(, США). Длины рестрицированных фрагментов регистрируют на геле в виде полос следующего размера в случае аллеля- 12820 п.н., в случае аллеля А - 148 п.н. дорожка 1 - маркер молекулярного веса 100 .р. дорожка 2 - Образец ДНК до рестрикции (148 п.н.) дорожка 3 - Образец ДНК с генотипом / дорожка 4 - Образец ДНК с генотипом А/А дорожка 5 - Образец ДНК с генотипом / Длина амплифицированного фрагмента составляет 148 п.н. (пар нуклеотидов). После проведения рестрикционного анализа на геле регистрируют полосы в случае аллеля- 128 и 20 п.н. в случае аллеля А - 148 п.н. В случае наличия у обследуемого неизмененного нормального генотипана геле вместо исходного фрагмента в 148 п.н. регистрируют фрагмент в 128 п.н. При наличии гетерозиготной мутации / исходный фрагмент в 148 п.н. заменяют на полосы в 128 и 20 п.н., при наличии функционально ослабленного(мутантного) аллеля А в гомозиготном состоянии (генотип АА) на ПАА геле регистрируют фрагмент в 148 п.н. Таким образом, в результате проведения молекулярно-генетического анализа у обследуемого выявляют один из 3 генотипических вариантов генапо его полиморфизму 308. Частоты аллелей и их ошибки определяют с использованием пакета статистической программы-1 (, 1981). Силу ассоциаций выражают в значениях относительного риска(),рассчитанного как относительный шанс ( ) по формл(а х ) / ( х с ), где а - число лиц с наличием и- с отсутствие генетического маркера среди больных, с и- число лиц соответственно с наличием и отсутствием этого маркера среди здоровых в том случае, когда один из показателей равен 0, относительный риск вычисляют по модифицированной формуле(2)(2) /(2)(2). При- нет ассоциации, 01 рассматривают как положительную ассоциацию заболевания с аллелем или генотипом (фактор риска) и 01 как отрицательную ассоциацию(фактор устойчивости), т.е. рассматривают значения 01 как фактор риска развития данной патологии,как предохраняющий фактор. Течение заболевания у больных с генотипом АА имеет прогностически неблагоприятный характер,быстропрогрессирующим течением с ранней инвалидизацией от 2 до 4 лет с момента начала заболевания. Пример 1. Больная Т., 41 год, инв.группы,госпитализирована в ревматологическое отделение с целью коррекции лечения 11.04.2009 г. Жалобы при поступлении боли практически во всех суставах, особенно в тазобедренных, утренняя скованность в течение дня, слабость, сердцебиение,образование узелков в области локтевых суставов,хруст при движениях в коленных суставах. Анамнез заболевания суставной синдром в виде артралгии голеностопных суставов с 2004 г. В течение года наблюдалась с диагнозом Реактивный артрит. С 2005 г. присоединяется утренняя скованность и стойкие явления артрита мелких суставов кистей симметричного характера, 24016 выносится диагноз Ревматоидный артрит. С базовой целью принимала лефлюномид (Арава) 20 мг/сут в течение 6 месяцев, который самостоятельно отменен в связи с аллопецией. Далее в течение года получала тауредон с положительным эффектом. Лечение прекращено из-за отсутствия препарата в аптечной сети. С этого времени назначается преднизолон в виде траптерапии 10 мг/сут кратковременно, но пациентка самостоятельно продолжает его принимать по настоящее время. В сентябре 2007 г. протезирование коленных суставов в КНР. Предварительно получив инфузию антицитокинового препарата против ФНО- инфликсимаба(ремикейда). Последующие инфузии не были проведены со слов больной из-за развившейся алопеции. Спустя 10 месяцев после протезирования наблюдалось гнойное осложнение правого коленного сустава с развитием свищей, что послужило поводом для повторного вмешательства. Настоящее ухудшение состояния в течение 8 месяцев с появлением болей в тазобедренных суставах, местной гипертермии правого коленного сустава. Госпитализирована по тяжести суставного синдрома. Объективные данные состояние средней степени тяжести, передвигается с помощью костылей. Кожа бледная, несколько одутловато лицо, умеренный кушингоид. Стрии на спине и бедрах. Избыточно развита подкожно-жировая клетчатка. Пальпируются подчелюстные лимфоузлы размером с фасоль, подвижные, безболезненные. Костно-суставная система ограничено самостоятельное передвижение, послеоперационные рубцы в области коленных суставов и выраженный хруст в них. Типичная ревматоидная кисть ульнарная девиация, межкостная атрофия мышц тыла кистей,экссудативно-пролиферативные изменения - пястно-фаланговых суставов симметрично, веретенообразные изменения проксимальных межфа-ланговых суставов правой кисти. Анкилоз лучезапястных суставов, разгибательная контрактура локтевых суставов с ревматоидными узелками, тугоподвижность правого плечевого сустава. Артралгия и ограничение движения левого тазобедренного сустава. В легких везикулярное дыхание. Сердечные тоны приглушены, ритмичны, пульс 86 ударов в мин., АД 130/80. Живот при пальпации мягкий,безболезненный. Печень и селезенка не увеличены. Отеков нет. В общеклиническом анализе крови гемоглобин 118 г/л, эритроциты -3,91012/л, лейкоциты - 10,2 109/л, СОЭ -43 мм/ч. Биохимический анализ фибриноген 954,4 ммоль/л, диспротеинемия, СРБ , РФ . Рентгенография кистей изменения соответствуют - стадии ревматоидного артрита. Клинический диагноз Ревматоидный артрит,полиартрит,серопозитивный,быстропрогрессирующее течение, активность , стадия-, ФНС -Ш. Ревматоидные узелки. Состояние после протезирования коленных суставов (2007 г.). При проведении молекулярно генетического исследования выявлен генотип АА, при котором развитие ревматоидного артрита имеет прогностически неблагоприятный характер. Больной подобрана более агрессивная терапия с использованием медикаментов,подавляющих костную резорбцию. Пример 2. Больная А., 52 лет, инв.группы,госпитализирована в ревматологическое отделение в январе 2010 г. Жалобы при поступлении утренняя скованность в течение 2 часов, боли в мелких суставах кистей и плечевых суставов, слабость, похудание, появление узелков в области локтевых суставов. Анамнез заболевания больна с 1997 г. (стаж болезни 13 лет). Дебют заболевания с симметричного полиартрита мелких суставов кистей и лучезапястных суставов, с постепенным вовлечением поражения плечевых и локтевых суставов. С базовой целью получала препарат золота - тауредон в 2006-2008 гг., с января 2009 г. на метотрексате 10 мг/неделю. Группу инвалидности присвоили спустя 9 лет с момента заболевания. Получает ежегодное стационарное лечение в ревматологическом отделении. Госпитализирована в плановом порядке в связи с активностью ревматоидного процесса и с целью коррекции лечения. Объективные данные состояние средней степени тяжести. Кожа обычной окраски,Лимфоузлы не увеличены. Подкожно-жировая клетчатка умеренно развита. Костно-суставная система межкостная атрофия мышц тыла кистей,экссудативно-пролиферативные изменения-пястно-фаланговых суставов обеих кистей,контрактура лучезапястных суставов,разгибательная контрактура локтевых суставов с ревматоидными узелками. Дефигурация и крепитация коленных суставов. В легких везикулярное дыхание. Сердечные тоны приглушены, ритмичны, пульс 86 ударов в мин., АД 130/80. Живот при пальпации мягкий,безболезненный. Печень и селезенка не увеличены. Отеков нет. В общеклиническом анализе крови гемоглобин 137 г/л, эритроциты -4,4 х 1012/л, лейкоциты - 6,8 х 109/л, СОЭ -32 мм/ч. Биохимический анализ фибриноген 365 ммоль/л, диспротеинемия, СРБ , РФ . Рентгенография кистей изменения соответствуютстадии ревматоидного артрита,подвывихи пястно-фаланговых суставов справа. Клинический диагноз Ревматоидный артрит,полиартрит,серопозитивный,медленнопрогрессирующее течение, активность , стадия ,ФНС . Ревматоидные узелки. При молекулярно - генетическом исследовании выявлен протективный генотип , что позволяет прогнозировать протекание данного заболевания в более доброкачественной форме с медленно- и малопрогрессирующим течением и минимальной или средней степенью активности ревматоидного 24016 процесса,без выраженных висцеральных проявлений и более поздней инвалидизацией. Для оценки значимости генав формировании подверженности развития РА в казахской этнической группе изучено Генотипы,аллели АА распределение частот аллелей и генотипов данного гена между здоровыми лицами и больными РА. Частоты генотипов и аллелей генапо его полиморфизму 308 в основной и контрольной группах исследования представлены в таблице (в ) 2 Всего 132 100,0 200 100,0 Примечание- имеются достоверные отличия от показателей контрольной группы, р 0,05 Как видно из таблицы, частота нормального организме пациентов с РА в казахской популяции,генотипав основной группе составила 7,63,3 что подтверждается значениями коэффициента и является более низкой в сравнении с показателем относительного риска . контрольной группы(37 ,04 ,8), различия Полученные данные свидетельствуют о том, у статистически достоверны (216,7 р 0,00001). пациентов в зависимости от носительства Частота гетерозиготного генотипав мутантного аллеля А в гомозиготном и основной группе составила 39,46,0 и имеет гетерозиготном состоянии можно еще до достоверное отличие от данных контрольной наступления заболевания провести коррекцию группы (59,04,9) (2 5 , 4 р 0,021). иммунных изменений для профилактики развития Получены достоверно высокие частоты РА. гомозиготного по мутантно-му аллелю генотипа АА Определениеявляется прогностически- 53,06 ,1 и мутантного аллеля А - 72 ,7 3,9 в значимым критерием развития провоспалительных основной группе в отличие от данных группы процессов в организме пациентов с РА. контроля (4,02,0, 33,53,3,250,5 и 247,4 Сопоставляя полученные генетические соответственно р 0,00001). результаты с клиническим течением заболевания Частота нормального аллелясоставляет обследованных больных, выявлено, что у лиц,27,33,9 в основной группе и является достоверно имеющих генотип АА, поражение суставов носит более низкой, чем в контрольной группе (66,53,3) ( более деструктивный характер вплоть до 247,4 р 0,00001). множественных анкилозов с высокой степенью Таким образом, частоты нормального генотипа активности ревматоидного процесса, зачастую сив основной группе достоверно более низкие, признаками системности. а частоты мутантного (патологического) генотипа Таким образом, заявляемый способ повышает АА и аллеля А достоверно более высокие в группе точность прогноза течения ревматоидного артрита,больных в отличие от группы здорового контроля (р позволяет определить активность течения процесса 0,05). и с учетом подбора адекватной фармакотерапии Данные по распределению генотипов повысить эффективность лечения. полиморфизма 308 генав основной и контрольной группах подтверждаются значениями коэффициента относительного риска,позволяющего определить степень риска развития ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ патологии с учетом носительства различных генотипов и гаплотипов. Способ прогнозирования тяжести течения Полученные результаты свидетельствуют о ревматоидного артрита, включающий исследование наличии взаимосвязи носительства патологического крови, проведение молекулярно - генетического мутантного аллеля А генас развитием анализа, отличающийся тем, что определяют изучаемой патологии. Носительство генотип гена, и при выявлении АА генотипа неблагоприятного генотипа АА и аллеля А в генапрогнозируют неблагоприятную форму гетерозиготном состоянии гена , является течения заболевания с быстропрогрессирующим статистически достоверным генетическим фактором течением и ранней инвалидизацией. риска развития провоспалительных процессов в