Способ опеределения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке крови у больных миомой матки

(51) 01 33/50 (2009.01) 01 33/52 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН Предлагаемый способ относится к области клинической медицины. Миома матки является одним из наиболее распространенных гинекологических заболеваний. Есть данные, что среди женщин в возрасте 18-60 лет частота встречаемости миомы матки составляет в среднем 0,9. У жительниц городов это заболевание диагностируется у 1,1 - 4,7 женщин в сельской местности миома матки отмечается реже. По другим данным каждая 4-5-ая женщина в мире страдает миомой матки. Миома матки представляет собой локальную гормональнозависимую гиперплазию гладких миоцитов миометрия. На основании исследований установлено, что изменения биологических свойств гормонозависимых тканей органов половой системы находятся в прямой корреляции с длительностью нарушений локального гормонального гомеостаза. Введение животным в течение длительного времени большого количества эстрогенов сопровождалось появлением у части из них фибро- и лейомиом матки, что легло в основу экспериментального моделирования этой патологии.(57) Предлагаемый способ относится к области клинической медицины. Способ определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке крови больных миомой матки,включающий взятие крови, отличающийся тем,что производят депротеинизацию этанолом,центрифугирование,колориметрирование на спектрофотометре при длине волны 540 нм в 96 луночном планшете с использованием реактива Грисса, состоящего из равных частей раствора 1 (0,05 растворанафтилэтилендиамида) и раствора 2 (1 раствор сульфаниламида в 30 уксусной кислоте). Внедрение данного способа позволяет количественно определить концентрацию метаболитов , использование для определения метаболитовдля скрининга как ранний маркер нарушения продукциив сосудистом эндотелии и проведение мониторинга изменения концентрации метаболитовв зависимости от применения фармакологических средств. В процессе опухолевого роста особая роль принадлежит изменению окислительного метаболизма по сравнению с нормой и развитию окислительного стресса в организме. Редокс-статус организма, в свою очередь, влияет на активность и характер действия оксида азота , играющего важную роль в процессе развития опухоли. Известно,что способом определения метаболитов оксида азота является газохроматографический метод. Кобылянский А.Г.,Кузнецова Т.В., Титов В.Н. Определение оксида азота в сыворотке и плазме крови человека методом высокоэффективной газожидкостной хроматографии Журнал Биомедицинская химия 2003.49.6. Определение метаболитов оксида азота в сыворотке крови больних миомой матки проводят путем взятия крови, распределения в газовой и жидких фазах хроматографа и учета с помощью плазменных ионных детекторов. Недостатком этого способа является то, что проведение его методически сложное и трудоемкое и требует специального дорогостоящего(72) Тусупкалиев Акылбек Балашович Укыбасова Талшин Мухадесовна Жумагулова Сагира Сейткуловна(73) Республиканское государственное казенное предприятие Западно-Казахстанский государственный медицинский университет имени Марата Оспанова Министерства здравоохранения Республики Казахстан(56) Кобылянский А.Г., Кузнецова Т.В., Соболева Г.Н., Бондаренко О.Н., Погорелова О.А., Титов В.Н.,Масенко В.И. Определение оксида азота в сыворотке и плазме крови человека методом высокоэффективной газожидкостной хроматографии//Биомедицинская химия, 2003, Т.49,выпуск 6, с. 597(54) СПОСОБ ОПЕРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ МЕТАБОЛИТОВ ОКСИДА АЗОТА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ У БОЛЬНЫХ МИОМОЙ МАТКИ 24017 лабораторного оборудования, и использование его в клинической практике затруднено. Задачей предполагаемого изобретения является разработка способа одноэтапного определения уровня метаболитов оксида азота с помощью реактива Грисса. Реактив Грисса состоит из равных частей раствора(0,05 раствор-нафтилэтилендиамина в воде) и раствора(1 раствор сульфаниламида в 30 уксусной кислоте). Уровень метаболитовопределяется колориметрически по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса. Способ включает определение содержания суммарных метаболитовв сыворотки крови больных миомой матки. Способ осуществляется следующим образом Сыворотку крови, взятую натощак, после низконитратного ужина(исключить прием корнеплодов, овощей, маринада, пиво и вино, то есть продукты с высоким содержанием нитратов) депротеинизируют в соотношении 12 с 96 этиловым спиртом. Затем центрифугируют при 2500 об/мин в течение 20 минут. Согласно данных ряда авторов метаболитыв сыворотке представлены в основном нитратами, поскольку нитриты легко окисляются (более 95 в течении 1 часа) и праткически отсутствуют в крови. Поскольку реактив Грисса позволяет определять только нитрит-ион, необходимо перевести нитраты в нитриты. Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии 3 и реакции диазотирования образовавшимся нитритом сульфаниламида с последующим развитием розовой окраски, интенсивность которой определяем спектрофотометрически. Исследования К 100 мкл супернатанта добавляли 100 мкл раствора ванадия хлорида и 100 мкл реактива Грисса. Смесь инкубируют в течение 30 минут при 37 С. Оптическую плотность измеряют при длине волны 540 нм в 96 луночном планшете. Количество нитрит иона рассчитывают в мкмоль/л по калибровочной кривой. Таким образом, измеряют содержание суммарных метаболитов . Пример Проведено исследование метаболитовв сыворотке крови здоровых ( 10) и больных миомой матки (12) в возрасте 30-35 лет. По данным исследования в контрольной группе уровень метаболитовсоставил 29,43 , 6 мкмоль/л, а в группе больных с миомой матки 42,1 мкмоль/л, то есть в 1,4 раза больше. Уровень метаболитовпо данным других исследователей в среднем составляет (25-58,3) мкмоль/л. Проведенные исследования показали, что эстрогены стимулируют активность нейронального и эндотелиальногосинтетаз. В физиологических условиях метаболитыпродуцируемые в тканях матки участвуют в процессах ауторелаксации,регуляции утилизации глюкозы и интенсивности кровообращения. У женщин с миомой матки выявлено увеличение концентрации метаболитов,что свидетельствует об активации эндотелиальногосинтазы. Характерная для развития миомы матки гиперэстрогенемия является одной из причин активации синтеза , который в условиях окислительного стресса трансформируется в цитотоксический пероксинитрит, способствующего дальнейшей интенсификации окислительного стресса и развитию опухоли. Таким образом, определение уровня метаболитовв сыворотке крови больных миомой матки с применением реактива Грисса,позволяет одноэтапное их определение в микроколичествах исследуемого материала (100 мкл) с использованием доступного лабораторного оснащения. Внедрение метода позволяет 1. количественно определить концентрацию метаболитов 2. использовать определение метаболитовдля скрининга как ранний маркер нарушения продукциив сосудистом эндотелии 3.мониторинг влияния фармакологических препаратов на уровень метаболитов . ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке крови больных миомой матки,включающий использование метода высокоэффективной газожидкостной хроматографии,отличающийся тем,что производят депротеинизацию этанолом,центрифугирование,колориметрирование на спектрофотометре при длине волны 540 нм в 96 луночном планшете с использованием реактива Грисса, состоящий из равных частей раствора- 0,05 раствора -нафтилэтилендиамида и раствора- 1 раствор сульфаниламида в 30 уксусной кислоте.