Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. – используемый для получения моноклональных антиидиотипических антител к иммуноглобулинам против экскреторно-секреторного антигена Opisthorchis felineus

(51) 61 39/40 (2006.01) 12 5/12 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ моноклональные антиидиотипические антител к иммуноглобулинам против экскреторносекреторного антигена. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей/,иммунизированных фрагментом МКА гибридомы 439,конъюгированным коллоидным золотом. Полученный штамм обозначают 410,который хранится в коллекции микроорганизмов РГП на ПВХ Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности КН МОН РК под регистрационным номером-10-14/. Секреция МКА на 3-4 день культивирования составляет 0,030 мг/мл в культуральной среде и 4 мг/мл в асцитической жидкости. Титры иммуноглобулинов культуральной среды по отношению к исходному антигену составляют в ТИФА-116, в асцитной жидкости 11600. Моноклональные антитела относятся к иммуноглобулинам класса М. Константа связывания 2,610-9 М. Моноклональные антитела могут быть использованы в разработке диагностических иммуноферментных тест-систем для серологической диагностики описторхоза.(72) Булашев Айтбай Кабыкешович Ескендирова Сауле Зиядиновна Сураншиев Жанболат Амреевич Серикова Шынар Байболин Жасулан Куатбекович(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ. - ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИИДИОТИПИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К ИММУНОГЛОБУЛИНАМ ПРОТИВ ЭКСКРЕТОРНО-СЕКРЕТОРНОГО АНТИГЕНА(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в разработке иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики описторхоза. Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующих Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в разработке иммунологических методов диагностики описторхоза. Диагноз на описторхоз ставится на основании паразитологических исследований, копроскопии,серологических реакций, таких как РИД и РНГА. Большой интерес представляет использование в диагностике описторхоза одного из высокочувствительных иммунологических тестов иммуноферментного анализа (ИФА), позволяющего обнаруживать антитела к специфичным антигенам паразита в сыворотке крови инвазированных пациентов. Имеющиеся данные (С.Н. Боровиков,2010 А.К. Булашев, 2011., .,.., 2012) позволяют сделать вывод о несомненной перспективности использования в данном тесте антигенов продуктов метаболизма, так называемого экскреторносекреторного антигена (ЭС-АГ). Однако, приготовление антигенов описторхиса требует выполнение таких видов работ, как отлов рыб изоляция метацеркариев заражение лабораторных животных с последующим их умерщвлением и извлечением половозрелого гельминта культивирование паразитадля аккумуляции метаболитов и наработки соматических антигенов очистка и хранение антигенов и др. (С.Н. Боровиков, 2010 А.К. Булашев, 2011 Котелкин А.Т., 2000) Это обстоятельство, во-первых, не позволяет получать в достаточном количестве стандартизированных антигенов гельминта и, во-вторых, заставляет задуматься над изысканием новых, более гуманных способов решения данной проблемы. Как известно,антитела воспринимаются иммунной системой организма как клональный продукт, несущий набор эпитопов (идиотипов). Эти эпитопы носят общее название - идиотип, и они могут стимулировать аутологичный антиидиотипический ответ. При введении антител в организм развивается иммунный ответ в виде антиидиотипов,представляющих собой внутренний образ эпитопов начального антигена. Следовательно,антиидиотипы могут использоваться в качестве специфических антигенов. (.1974 А.А. Кущ, Т.А. Посевая и др. 1991 Мареева Т.Ю. 1995 Б.Б. Гнеденко,С.Г. Морозов и др. 2006). В этой связи, получение гибридом продуцентов моноклональных антиидиотипических антител, позволит отказаться от заражения лабораторных животных и весьма дорогостоящих работ по культивированию гельминта в лабораторных условиях для наработки ЭС-АГ. Другими словами,создание гибридомы,продуцирующей антиидиотипические антитела,обеспечить производителя диагностикума высокоспецифичными, стандартизированными и дешевыми антигенами гельминта описторхиса, не имея при этом дело с самим возбудителем этой болезни и соблюдая принципы гуманности в производстве биопрепаратов. 2 Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующий моноклональные антиидиотипические антитела к иммуноглобулинам против экскреторносекреторного антигена. Полученный штамм обозначают 410,который депонирован в коллекции микроорганизмов РГП на ПВХ Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности КН МОН РК (080409,Жамбылская область, Кордайский район, п.г.т. Гвардейский.) под регистрационным номером -1014/ и характеризуется следующими признаками. Штамм гибридомы получают следующим образом. Мышам линии / в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг антиген - -фрагмент МКА гибридомы 439,конъюгированные коллоидным золотом в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда. На 7, 11, 12, 13-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг этого же антигена в забуференном физиологическом растворе (ЗФР),7,2-7,4. Спустя 4 дня после последней иммунизации извлекают селезенку мышей, которые имеют высокие титры антител в сыворотке крови по результатам твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА). Клетки селезенки (В-лимфоциты) иммунных мышей в количестве 5106 гибридизируют с клетками миеломы 63-8-563(1106) в 1 мл неполной питательной среды,содержащей 45 полиэтиленгликоль с молекулярной массой 4000 и 10 диметилсульфоксид. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля их высевают в ячейки 96-луночной панели на слой перитонеальных макрофагов мыши. На следующий день в эти лунки вносят селективную питательную среду, содержащую гипоксантин-аминоптеринтимидин (ГАТ). Через 10-14 дней после слияния из лунок, имеющих колонии клеток размером 2-3 мм,отбирают культуральную среду, содержащую антитела для определения продуктивности гибридных клеток. Тестирование проводят методом ТИФА с использованием конъюгата фрагментов МКА и кроличьих иммуноглобулинов к антителам мыши, меченых пероксидазой хрена. В течение 21 дня после слияния, гибридные клетки культивируют на среде с ГАТ и затем постепенно переводят на среду, содержащую гипоксантинтимидин (ГТ) и полную среду -1640. Клоны гибридных клеток,продуцирующих моноклональных антиидиотипических антител к-фрагмент МКА гибридомы 439,конъюгированные коллоидным золотом, дважды клонируют методом лимитирующих разведений. После второго клонирования 95 субклонов должны продуцировать антитела к тестируемому антигену. Морфологические признаки. Гибридные клетки представляют собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Культуральные признаки. Гибридные клетки в условияхадаптированы к росту в среде-1640,содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коров (10-15) 20 мл/л 200 мМ -глютамина- 3,375 г/л 2 меркаптоэтанола - 0,003 мл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия - 3,7 г/л. Клетки культивируют в пластиковых матрацах при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Характер роста - стационарная суспензия. Посевная концентрация 2106 клеток в 1 мл. Рост клеток ведут до достижения плотности монослоя в пределах 75-80 или концентрации клеток не выше 0,5106 в 1 мл. Частота пассирования 3-4 суток. В условияхасцитическая жидкость накапливается в течение 1014 дней после введения клеток в организм мышей линии В/. Продуктивность штамма. На 3-4-й день культивирования гибридомы концентрация МКА составляет 0,030 мг/мл в культуральной среде и 4 мг/мл в очищенной асцитной жидкости. Титры иммуноглобулинов культуральной среды по отношению к исходному антигену составляют в ТИФА-18-116 в асцитной жидкости 11600. Характеристика полезного продукта. МКА относятся к иммуноглобулинам класса М. Константа связывания 2,610-9 М. Методы оценки специфичности МКА ТИФА. Контаминация. Контаминация бактериями,грибами и микоплазмами не обнаружена. Криоконсервирование. Гибридные клетки снимают с матраца мягким пипетированием и переносят в отдельные центрифужные пробирки. Осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. К осадку гибридных клеток добавляют сыворотку плода коровы (0,9 мл), а затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10. Суспензию гибридных клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающими крышками по 1 мл (1-5106 кл.),помещают в коробку из пенопласта и переносят в низкотемпературный холодильник при -70 С на 1618 часов. Затем ампулы с гибридными клетками переносят в контейнеры с жидким азотом (-196 С). Условия размораживания. Ампулу с гибридными клетками вынимают из сосуда с жидким азотом и помещают в водяную баню, нагретую до 37 С. Как только растают кусочки льда, суспензию гибридных клеток переносят в отдельную стерильную центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной неполной ростовой среды, отмывают один раз путем центрифугирования в течение 10 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют,осадок клеток ресуспендируют в полной ростовой среде, нагретой до комнатной температуры, и высевают в ячейки 24-луночного планшета с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Штамм гибридомы 410 используют следующим образом. Пример 1. Гибридные клетки высевают в пластиковые матрацы с площадью 25 см 3 по 5105 клеток в 5 мл ростовой среды и инкубируют 3-4 дня при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Культуральную среду собирают и центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин с целью отделения клеток от надосадочной жидкости, содержащей антитела. Для наработки препаративного количества МКА осадок гибридных клеток разводят неполной ростовой средой в объеме 0,5 мл и вводят внутрибрюшинно (в концентрации 1-2 млн. клеток) мышам линии В/, которым предварительно инъецировали пристан(2,6,10,14-тетраметилпентадексан). Через 10-14 дней после прививки гибридных клеток мышей забивают путем цервикальной дислокации, стерильным шприцом отсасывают асцитную жидкость, вводя иглу в брюшную полость. Асцитную жидкость собирают в центрифужные пробирки и очищают от гибридных клеток центрифугированием в течение 6-8 мин при 1000 об/мин. Очистку МКА осуществляют методом высаливания насыщенным раствором сульфата аммония. Специфичность антиидиотипических антител определяют в сэндвич ИФА. Для этого ячейки 96 луночного планшета для иммунологических реакций сенсибилизируют поликлональными антителами собаки,инвазированной метацеркариями описторхиса, в концентрации 10 мкг/мл в бикарбонатном буфере 9,5. Инкубируют при 4 С в течение ночи. Затем планшет отмывают 3 раза фосфатно-солевом буфере с добавлением 0,05-ным твином-20 (ФСБ-Тв) и 3 раза ФСБ. Активные центры полистироловой лунки нейтрализуют желатином. Затем в лунки вносят образцы асцитной жидкости,содержащей антиидиотипические антитела начиная с разведения 1100 и выше в 0,1 мл ФСБ-Тв. Одновременно ставят контроли с культуральной жидкостью миеломных клеток в тех же разведениях и с ФСБТв. Затем планшет накрывают крышкой и инкубируют в термостате при 37 С в течении 1 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют,повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл рабочего разведения конъюгата(антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой) в ФСБ-Тв. Через 1 час после инкубации при 37 С повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл свежеприготовленной субстрат (однокомпонентный раствор тетраметилбензидина - ТМБ). Затем планшет накрывают крышкой и оставляют в темном месте при комнатной температуре. Через 10-15 мин экспозиции реакцию останавливают путем внесения в каждую лунку по 0,1 мл 2 М раствора 24. Результаты реакции учитывают на спектрофотометре путем измерения оптической плотности жидкости в каждой лунке при длине волны 492 нм. Положительная реакция характеризуется появлением в лунках темнокоричневого окрашивания, при отрицательной содержимое лунок остается бесцветным или имеет светло-желтое окрашивание. Титром моноклональных антиидиотипических антител 3 считают их максимальное разведение, величина оптической плотности в котором в 2 и более раза превосходит оптическую плотность в лунках с отрицательным контролем. Титр антиидиотипических антител продуцируемых штаммом 410 по результатам реакции составляет 11600. Таким образом,результаты опыта свидетельствуют о том, что антитела гибридомы 410, имея специфичность к идиотипам МКА штамма 439, распознаются поликлональными антителами как антиген возбудителя описторхоза. Пример 2. Определение способности антиидиотипических антител индуцировать в организме животных иммунный ответ к исходному антигену - ЭС-Аг. Для этой цели мышей линии В/ иммунизируют антиидиотипическими антителами в дозе по 100 мкг в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда. Затем на 7, 11, 12, 13 дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг антигена в забуференном физиологическом растворе,7,27,4. На 4-й день после последней инъекции иммунную сыворотку тестируют в ИФА на взаимодействие с ЭС-АГ. В качестве положительного контроля используют сыворотку, полученную при иммунизации с ЭС-АГ. В качестве отрицательного контроля - сыворотку неиммунизированной мыши. По результатам иммуноферментного анализа антиидиотипические антитела стимулировали синтез противоописторхозных антител в титрах 16400-112800. Титр положительного контроля составил 13200-112800. В случае отрицательного контроля реакция отсутствовала. Результаты исследований свидетельствуют о том, что антиидиотипические антитела клонов 410, как внутренний образ ЭС-Аг, вызвало продуцирование антител третьего порядка Ат 3 против исходного антигена и обладают соответствующими иммуногенными свойствами. Таким образом, АИАТ гибридом 410 могут быть использованы в качестве антигена при разработке иммунологических тестов для диагностики описторхоза. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамп гибридных культивируемых клеток животных., депонирован в коллекции микроорганизмов РГП на ПВХ Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности КН МОН РК под регистрационным номером М-10-14/,продуцирующий моноклональные антиидиотипические антитела к иммуноглобулинам против экскреторно-секреторного антигена.