Штамм гибридных кульвитируемых клеток животных Mus musculus L. – используемый для получения моноклональных антител к экскреторно-секреторному антигену гельминтов Opisthorchis felineus

(51) 61 39/40 (2006.01) 12 5/12 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ клеток животных, продуцирующих моноклональные антител к экскреторносекреторному антигену гельминтов. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей /, иммунизированных экскреторносекреторным антигеном гельминтов. Полученный штамм обозначают 439,который хранится в коллекции микроорганизмов РГП на ПВХ Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности КН МОН РК под регистрационным номером-11-14/. Секреция МКА на 3-4 день культивирования составляет 0,025-0,050 мг/мл в культуральной среде и 2-4 мг/мл в асцитической жидкости. Титры иммуноглобулинов культуральной среды по отношению к исходному антигену составляют в ТИФА-132, в асцитной жидкости 16400. Моноклональные антитела относятся к иммуноглобулинам класса М. Константа связывания 610-5 М. Моноклональные антитела могут быть использованы в разработке диагностических иммуноферментных тест-систем для серологической диагностики описторхоза.(72) Булашев Айтбай Кабыкешович Боровиков Сергей Николаевич Сураншиев Жанболат Амреевич Куйбагаров Марат Амангельдыевич Серикова Шынар(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬВИТИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ. - ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЭКСКРЕТОРНОСЕКРЕТОРНОМУ АНТИГЕНУ ГЕЛЬМИНТОВ(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в разработке иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики описторхоза. Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в разработке иммунологических методов диагностики описторхоза. Диагноз на описторхоз ставится на основании паразитологических исследований, а именно исследования дуоденального сока и копроскопии с целью обнаружения яиц описторхисов с учетом клинико-эпидемиологических данных. Однако однократно полученный отрицательный результат отнюдь не свидетельствует об отсутствии описторхозной инвазии. Отсутствие яиц паразита может быть обусловлено невозможностью обнаружения яиц у людей на ранней стадии заболевания, когда еще отсутствуют половозрелые мариты описторхисов, способные к яйцепродукции цикличностью яйцепродукции гельминтов неравномерным распределением яиц по содержимому толстой кишки невысокой вероятностью обнаружения яиц паразитов при низкой интенсивности инвазии. В этой связи,большой интерес представляет использование в диагностике описторхоза одного из высокочувствительных иммунологических тестов иммуноферментного анализа (ИФА), позволяющего обнаруживать антитела к специфичным антигенам паразита в сыворотке крови инвазированных пациентов. Имеющиеся данные (С.Н. Боровиков,2010 А.К. Булашев, 2011 А., Е.,.., 2012) позволяют сделать вывод о несомненной перспективности использования в данном тесте антигенов продуктов метаболизма, так называемого экскреторносекреторного антигена (ЭС-АГ). В обнаружении такого антигена неоценимую помощь могут оказать моноклональные антитела (МКА). Известны коллекции МКА против возбудителя описторхоза, относящийся к виду(прототипом) является штамм гибридомы,используемый для получения МКА к белку ЭС-АГс молекулярной массой 105 кДа(Котелкин А.Т. Разумов И.А. Локтев В.Б. 1999). Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующий МКА к другому белку ЭС-АГ, а именно к фракции с молекулярной массой 28 кД. Полученный штамм обозначают 439, который депонирован в коллекции микроорганизмов РГП на ПВХ Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности Н МОН РК (080409,Жамбылская область, Кордайский район, п.г.т. Гвардейский.) под регистрационным номером -1114/ и характеризуется следующими признаками. Штамм гибридомы получают следующим образом. Мышам линии ВАВ/с в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг 2(ЭС-АГ) гельминтовв 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда. На 7, 11, 12, 13-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг этого же антигена в забуференном физиологическом растворе (ЗФР),7,2-7,4. Спустя 4 дня после последней иммунизации извлекают селезенку мышей, которые имеют высокие титры антител в сыворотке крови по результатам твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА). Клетки селезенки (В-лимфоциты) иммунных мышей в количестве 1107 гибридизируют с клетками миеломы 63-8-563(1106) в 1 мл неполной питательной среды,содержащей 45 полиэтиленгликоль с молекулярной массой 4000 и 10 диметилсульфоксид. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля их высевают в ячейки 96-луночной панели на слой перитонеальных макрофагов мыши. На следующий день в эти лунки вносят селективную питательную среду, содержащую гипоксантин-аминоптеринтимидин (ГАТ). Через 10-14 дней после слияния из лунок, имеющих колонии клеток размером 2-3 мм,отбирают культуральную среду, содержащую антитела для определения продуктивности гибридных клеток. Тестирование проводят методом ТИФА с использованием ЭС-АГ гельминтови кроличьих иммуноглобулинов к антителам мыши, меченых пероксидазой хрена. В течение 21 дня после слияния, гибридные клетки культивируют на среде с ГАТ и затем постепенно переводят на среду, содержащую гипоксантинтимидин (ГТ) и полную среду -1640. Клоны гибридных клеток, продуцирующих МКА к ЭС-АГ,дважды клонируют методом лимитирующих разведений. После второго клонирования 95 субклонов должны продуцировать антитела к тестируемому антигену. Морфологические признаки. Гибридные клетки представляют собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Культуральные признаки. Гибридные клетки в условияхадаптированы к росту в среде-1640,содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коров (10-15) 20 мл/л 200 мМ -глютамина Н - 3,375 г/л 2 меркаптоэтанола - 0,003 мл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия - 3,7 г/л. Клетки культивируют в пластиковых матрацах при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Характер роста - стационарная суспензия. Посевная концентрация 2106 клеток в 1 мл. Рост клеток ведут до достижения плотности монослоя в пределах 75-80 или концентрации клеток не выше 0,5106 в 1 мл. Частота пассирования 3-4 суток. В условияхасцитическая жидкость накапливается в течение 1014 дней после введения клеток в организм мышей линии /. Продуктивность штамма. На 3-4-й день культивирования гибридомы концентрация МКА составляет 0,025-0,050 мг/мл в культуральной среде и 2-4 мг/мл в очищенной асцитной жидкости. Титры иммуноглобулинов культуральной среды по отношению к исходному антигену составляют в ТИФА-132, в асцитной жидкости 16400. Характеристика полезного продукта. МКА относятся к иммуноглобулинам класса М. Константа связывания 610-5 М. Методы оценки специфичности МКА ТИФА. Контаминации. Контаминация бактериями,грибами и микоплазмами не обнаружена. Криоконсервирование. Гибридные клетки снимают с матраца мягким пипетированием и переносят в отдельные центрифужные пробирки. Осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. К осадку гибридных клеток добавляют сыворотку плода коровы (0,9 мл), а затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10. Суспензию гибридных клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающими крышками по 1 мл (1-5106 кл.),помещают в коробку из пенопласта и переносят в низкотемпературный холодильник при -70 С на 1618 часов. Затем ампулы с гибридными клетками переносят в контейнеры с жидким азотом (-196 С). Условия размораживания. Ампулу с гибридными клетками вынимают из сосуда с жидким азотом и помещают в водяную баню, нагретую до 37 С. Как только растают кусочки льда, суспензию гибридных клеток переносят в отдельную стерильную центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной неполной ростовой среды, отмывают один раз путем центрифугирования в течение 10 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют,осадок клеток ресуспендируют в полной ростовой среде, нагретой до комнатной температуры, и высевают в ячейки 24-луночного планшета с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Штамм гибридомы 439 используют следующим образом. Пример 1. Гибридные клетки высевают в пластиковые матрацы площадью 25 см 3 по 5105 клеток в 5 мл ростовой среды и инкубируют 3-4 дня при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Культуральную среду собирают и центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин с целью отделения клеток от надосадочной жидкости, содержащей антитела. Для наработки препаративного количества МКА осадок гибридных клеток разводят неполной ростовой средой в объеме 0,5 мл и вводят внутрибрюшинно (в концентрации 1-2 млн. клеток) мышам линии /, которым предварительно инъецировали пристан(2,6,10,14-тетраметилпентадексан). Через 10-14 дней после прививки гибридных клеток мышей забивают путем цервикальной дислокации, стерильным шприцом отсасывают асцитную жидкость, вводя иглу в брюшную полость. Асцитную жидкость собирают в центрифужные пробирки и очищают от гибридных клеток центрифугированием в течение 6-8 мин при 1000 об/мин. Очистку МКА осуществляют методом высаливания насыщенным раствором сульфата аммония. Специфичность определяют в ТИФА с использованием исходного ЭС-АГ,близкородственных и гомологичных антигенов. Для проведения ТИФА на 96-луночный полистироловый планшет сорбируют антиген в концентрации 10 мкг/мл в бикарбонатном буфере 9,5. Инкубируют при 4 С в течение ночи или 2 часа при 37 С. Затем планшет отмывают 3 раза фосфатно-солевом буфере с добавлением 0,05 твином-20 (ФСБ-Тв) и 3 раза ФСБ. В лунках вертикальных рядов планшета готовят двукратные разведения исследуемой культуральной жидкости(КЖ) или асцитной жидкости (АЖ) начиная с разведения 1100 и выше в 0,1 мл ФСБ-Тв. Одновременно ставят контроли с культуральной жидкостью миеломных клеток в тех же разведениях и с ФСБ-Тв. Затем планшет накрывают крышкой и инкубируют в термостате при 37 С в течении 1 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют,повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл рабочего разведения конъюгата(антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой) в ФСБ-Тв. Через 1 час после инкубации при 37 С повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл свежеприготовленной субстрат (однокомпонентный раствор тетраметилбензидина - ТМБ). Затем планшет накрывают крышкой и оставляют в темном месте при комнатной температуре. Через 10-15 мин экспозиции реакцию останавливают путем внесения в каждую лунку по 0,1 мл 2 М раствора 2 О 4. Результаты реакции учитывают на спектрофотометре путем измерения оптической плотности жидкости в каждой лунке при длине волны 492 нм. Положительная реакция характеризуется появлением в лунках темнокоричневого окрашивания, при отрицательной содержимое лунок остается бесцветным или имеет светло-желтое окрашивание. Титром моноклональных антител считают их максимальное разведение, величина оптической плотности в котором в 2 и более раза превосходит оптическую плотность в лунках с отрицательным контролем. Результаты опыта по определению специфичности МКА в ТИФА представлены в таблице 1. Титры МКА Культуральная Асцитная жидкость жидкость 2 соматический антиген гельминтов 14 1800 экскреторно-секреторный антиген протосколексов РО РО 3 эхинококков 4 Соматический антигенРО РО 5 Соматический антигенРО РО Примечание - РО - реакция отрицательная. Как видно из приведенных в таблице 1 при 37 С), затем отмывают по 3 раза ФСБ и результатов, полученные моноклональные антитела инкубируют 1,5 ч при 37 С с МКА из очищенной проявляют высокую активность к экскреторно- асцитной жидкости, разведенной 1100 ФСБ-Тв. секреторному антигену гельминтовПосле этого носитель отмывают 3 раза ФСБ-Тв ии не реагируют с антигенами других ФСБ, затем его выдерживают в рабочем разведении возбудителей других гельминтозов (цистицеркоз, антимышиных антител, меченных пероксидазой эхинококкоз, меторхоз) можно сделать заключение (1 ч при 37 С). Повторяют процедуру отмывки и о специфичности данных МКА к исходному проявляют реакцию с помощью 4-хлор-1-нафтола. антигену. Результаты проведенного иммуноблотинга Таким образом,результаты опыта показали специфичность моноклональных антител свидетельствуют о специфичности МКА гибридомы гибридомы 439 антигенной фракции ЭС-АГ с 439 к экскреторно-секреторному антигену молекулярной массой 28 кД. гельминтов, что позволяет получать на их основе эффективные ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ диагностические препараты для диагностики описторхоза. Штамм гибридных кульвитируемых клеток Пример 2. Образны экскреторно-секреторного животных., депонирован в антигена в количестве 10-мкг подвергают коллекции микроорганизмов РГП на ПХВ Научноэлектрофорезу в 10 полиакриламидном геле в исследовательский институт проблем присутствии додецилсульфата натрия. биологической безопасности КН МОН РК по Электрофореграмму переносят на регистрационным номером М-11-14/,нитроцеллюлозную мембрану в течение 2 часов при продуцирующий моноклональные антитела к силе тока 60 В и 250 мА. Свободные участки экскреторно-секреторному антигену гельминтов носителя блокируют 1 бычьим сывороточнымс молекулярной массой 28 кД. альбумином в ФСБ,7,2-7,4 (18 ч при 4 С или 2 ч