Способ изготовления бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы

(51) 61 39/10 (2006.01) 01 33/569 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ штамма 19 на эритрит-агаре с добавлением экстракта дрожжей, гидролизата казеина, казеинового пептона, глюкозы, калия фосфорнокислого двузамещенного,калия фосфорнокислого однозамещенного, 4, 4,4, 4, 12, -глутаминовой кислоты, цистеина -лизина, -гистидина -аланина, метионина,тиамина никотиновой кислоты пантотената кальция рибофлавина, пиридоксина,биотина, культивирование проводят в течение 48 часов при температуре 37 С, с последующим смывов культуры 0,01-ным раствором мертиолята,инактивацией при 80 С в течение 60 минут,реуспендирование инактивированных клеток,окрашивание 1-ным водным раствором краски бенгальской розовой при перемешивании в течение 1 часа, центрифугирование, ресуспендирование буферным разбавителем, включающем едкий натр,мертиолятный физиологический раствор и молочную кислоту с последующей стандартизацией целевого продукта. Способ изготовления бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы обеспечивает повышение выхода целевого продукта, снижение себестоимости и продолжительности изготовления препарата.(72) Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Хусаинов Дамир Микдатович Шанбаев Бакдаулет Унербекович Алимбекова Меруерт Ерболатовна збеков Марлен Болатжанлы Исаева Асем Амануллаевна Баязерова Татьяна Керимовна Сапаров Аян Анаркулович Маукеев Куаныш Абылкасымович(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ РОЗ БЕНГАЛ ПРОБЫ(57) Изобретение относится к ветеринарии, а именно к технологии производства бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы, применяющегося при выявлении бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Способ изготовления бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы путем культивирования Изобретение относится к ветеринарии, а именно к технологии производства бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы, применяющегося при выявлении бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Известен способ изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСР путем культивирования штамма 19 на плотной питательной среде,отделение бактериальных клеток,их инактивацию,окрашивание 1-ным водным раствором краски бенгальской розовой,центрифугирование и ресуспендирование буферным разбавителем с последующей стандартизацией целевого продукта,при этом культивирование осуществляют на печеночно-мартеновский агаре на переваре Хоттингера в течение 72 часов, а смыв осуществляют фенолизированным физиологическим раствором, (Ветеринарные препараты / Справочник под ред. Д.Ф. Осидзе. М. Колос, 1981, с.185-188). Однако этот способ не обеспечивает достаточного накопления бруцелл,является трудоемким, длительным. Задачей является разработка способа изготовления бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы, обеспечивающего повышение выхода целевого продукта, снижение себестоимости и продолжительности изготовления препарата. Это достигается путем культивирования на среде, содержащей эритрит-агар с добавлением,масс. 0,018-0,022 экстракта дрожжей, 0,008-0,012 гидролизата казеина 0,16-0,2 казеинового пептона 0,18-0,22 глюкозы 0,018-0,022 калия фосфорнокислого двузамещенного 0,018-0,022 калия фосфорнокислого однозамещенного 0,0030,005 4 0,0005-0,0015 4 0,003-0,005 4 0,0005-0,0015 4 0,0005-0,0015 СоС 12 0,005-0,015 -глутаминовой кислоты, 0,005-0,015 цистеина 0,005-0,015 -лизина, 0,005-0,015 гистидина 0,005-0,015 -аланина, 0,005-0,015 метионина, 0,0001-0,0002 тиамина 0,0001-0,0002 никотиновой кислоты 0,0001-0,0002 пантотената кальция 0,0001-0,0002 рибофлавина, 0,0001-0,0002 пиридоксина,0,0000001-0,0000002 биотина,культивирование проводят в течение 48 часов при температуре 37 С, с последующим смывов культуры 0,01-ным раствором мертиолята,инактивацией при 80 С в течение 60 минут,реуспендирование инактивированных клеток,окрашивание 1-ным водным раствором краски бенгальской розовой при перемешивании в течение 1 часа, центрифугирование, ресуспендирование буферным разбавителем, включающем едкий натр,мертиолятный физиологический раствор и молочную кислоту с последующей стандартизацией целевого продукта. Способ изготовления бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы осуществляется следующим образом. Пример. Бруцеллы штамма 19 высевают на твердую питательную среду (эритритагар) с добавлением масс. 0,02 экстракта дрожжей 0,01 гидролизата казеина 0,18 2 казеинового пептона 0,2 глюкозы 0,02 калия фосфорнокислого двузамещенного 0,02 калия фосфорнокислого однозамещенного 0,004 4 0,001 4 0,004 4 0,001 4 0,001 12 0,01 -глутаминовой кислоты, 0,01 цистеина 0,01 -лизина, 0,01 -гистидина 0,01 аланина, 0,01 -метионина, 0,00015 тиамина 0,00015 никотиновой кислоты 0,00015 пантотената кальция 0,00015 рибофлавина,0,00015 пиридоксина, 0,00000015 биотина, помещенную в посевную четверть. Посев культуры производят путем увлажнения питательной среды посевным материалом, для чего используют 2-суточную агаровую культуру бруцелл. Засеянные четверти помещают в термостат при температуре 37 С на 48 часов. После окончания выращивания культуры смывают стерильным 0,01-ным мертиолятным физиологическим раствором с 7,0-7,2 из расчета 35-50 мл на одну бутыль. Смытые культуры сливают в бутыли по 10 л, доводят концентрацию 0,01-ным мертиолятным физиологическим раствором до 180-220 млрд. м.к./см 3 и прогревают при 80 С в течение 60 минут. Прогретую суспензию проверяют на чистоту и стерильность путем микроскопии мазков, окрашенных по Грамму и Козловскому, и высева на МПБ, МПА, печеночномартеновский агар и бульон с переваром Хоттингера, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро - по две пробирки и два флакона с 50 см 3 бульона на каждый образец. За высевами наблюдают в течение 10 дней. После определения стерильности бактериальной суспензии штамма 19, берут пробу и определяют необходимое количество краски бенгальской розовой. Суспензию бруцелл окрашивают 1-ным водным раствором краски бенгальской розовой в течение 24 ч при комнатной температуре. Суспензию окрашенных бруцелл центрифугируют с целью отделения бакмассы от избытка краски,мертиолятного физиологического раствора и остатков питательной среды и ресуспендируют буферным разбавителем при перемешивании в течение 1 часа. Полученный антиген стандартизируют по активности с национальной агглютинирующей бруцеллезной сывороткой, содержащей в 1 см 3 1000 международных единицантител. Антиген считают активным и разрешают к выпуску, если он дает агглютинацию интенсивностью в 4 креста с сывороткой в разведении 110, содержащей 50 ,1,5-2 креста с сывороткой в разведении 120 (35 ) и отрицательную реакцию с сывороткой в разведении 135 (28,5 ). Если антиген отвечает указанным требованиям, приготовленную серию стерильно разливают во флаконы емкостью 20 см 3. Флаконы с антигеном плотно закрывают резиновыми пробками и обкатывают металлическими колпачками,а затем просматривают в проходящем свете. Предложенный способ изготовления антигена позволяет получить 800 млрд. м.к./см 3, тогда как аналог позволяет получить 500 млрд. м.к./см 3. Соответственно количество полученного по предложенному способу стандартизированного роз бенгал антигена возрастает на 60. Пластинчатую реакцию агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном применяют при исследовании сыворотки крови для диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз,лошадей, свиней, верблюдов и северных оленей. Сравнительные данные по существующему и предлагаемому способам изготовления единого бруцеллезного антигена приведены в табл. 1 По данным табл. 1 видно, что предложенный способ изготовления антигена требует меньших затрат питательной среды, времени на изготовление и способствует получению большего количества роз бенгал антигена. Были проведены производственные испытания роз бенгал антигена,изготовленного по предлагаемой методике. Для сравнения использовали роз бенгал антиген, изготовленный по существующей методике. Для контроля сыворотку также исследовали в серологических реакциях реакции агглютинации (РА), реакции связывания комплемента (РСК). Исследования проводили на животных неблагополучных по бруцеллезу хозяйств, а также в благополучных хозяйствах. Всего было подвергнуто исследованию 545 голов крупного рогатого скота. Полученные при этом данные приведены в табл. 2. Как видно из данных табл. 2, в результате проведенных испытаний установлена высокая активность и специфичность антигена в роз бенгал пробе. Таблица 1 Сравнительные данные по технологии получения антигена Существующая (прототип) технология Предлагаемая технология (новая) получения получения Печеночно-мартеновский агар на Среда эритрит-агар с добавлением, масс. 0,018-0,022 экстракта переваре Хоттингера, расфасованный в дрожжей, 0,008-0,012 гидролизата казеина 0,16-0,2 казеинового посевные четверти. Выход антигена с пептона 0,18-0,22 глюкозы 0,018-0,022 калия фосфорнокислого 1 дм 3 питательной среды 0,7 дм 3 двузамещенного 0,018-0,022 калия фосфорнокислого однозамещенного 0,003-0,005 4 0,0005-0,0015 4 0,0030,005 4 0,0005-0,0015 4 0,0005-0,0015 СС 12 0,0050,015 -глутаминовой кислоты, 0,005 - 0,015 -цистеина 0,0050,015 -лизина, 0,005-0,015 -гистидина 0,005-0,015 -аланина,0,005-0,015 - метионина, 0,0001-0,0002 тиамина 0,0001-0,0002 никотиновой кислоты 0,0001-0,0002 пантотената кальция 0,00010,0002 рибофлавина, 0,0001-0,0002 пиридоксина, 0,00000010,0000002 биотина 3. Выход антигена с 1 дм 3 питательной среды 1,0 дм 3 Культивирование в термостате при 37 С Культивирование в термостате при 37 С 48 часов 72 часа Слив конденсата из четвертей Нет Смыв культуры 0,5 фенолизированным Смыв культуры 0,01-ным мертиолятным физраствором физраствором Сбор культуры Сбор культуры Инактивация антигена в водяной бане Инактивация антигена в водяной бане или реакторе при 80 С или реакторе при 80 С 60 мин 60 мин Окраска роз-бенгалом Окраска роз-бенгалом 200 см 3 роз бенгал антигена с одной 320 см 3 роз бенгал антигена с одной четверти четверти Таблица 2 Результаты испытания активности и специфичности предлагаемого роз бенгал антигена в сравнении с существующим Вид животных Крупный рогатый скот Крупный рогатый скот Благополучие Количество хозяйства по исследованных проб бруцеллезу сывороток Неблагополучное 296 Благополучное ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ изготовления бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы,включающий Результаты исследования по Роз бенгал РА РСК пробе 24 24 24 культивирование штамма Вг 19 на плотной питательной среде,отделение бактериальных клеток,их инактивацию,окрашивание 1-ным водным раствором краски 3 бенгальской розовой,центрифугирование и ресуспендировапие буферным разбавителем с последующей стандартизацией целевого продукта,отличающийся тем, что культивирование проводят на эритрит-агаре с добавлением, мас. 0,018-0,022 экстракта дрожжей, 0,008-0,012 гидролизата казеина, 0,16-0,2 казеинового пептона, 0,18-0,22 глюкозы, 0,018-0,022 калия фосфорнокислого двузамещенного,0,018-0,022 калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,003-0,005 4, 0,0005-0,0015 4, 0,003-0,005 4,0,0005-0,0015 4, 0,0005-0,0015 СоС 12, 0,005 0,015 -глутаминовой кислоты, 0,005-0,015 цистеина, 0,005-0,015 -лизина, 0,005-0,015 гистидина, 0,005-0,015 -аланина, 0,005-0,015 метионина, 0,0001-0,0002 тиамина, 0,0001-0,0002 никотиновой кислоты, 0,0001-0,0002 пантотената кальция 0,0001-0,0002 рибофлавина, 0,0001-0,0002 пиридоксина,0,0000001-0,0000002 биотина,культивирование осуществляют в течение 48 часов,смыв осуществляют мертиолятным физиологическим раствором.