Способ получения бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы (РБП)

КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Способ осуществляется путем культивирования в течение 48 часов при температуре 37 С трех вакцинных штаммов-1,19 и 61 на среде, содержащей эритрит-агар с добавлением 0,02 цистина и 0,02 дрожжевого экстракта. Далее смывают культуры 0,5 -ным раствором фенола, инактивируют при 80 С в течение 60 минут. После охлаждения бактериальные суспензии трех штаммов смешивают в соотношении 111, определяют необходимое количество краски розовой бенгальской и окрашивают 1 -ным водным ее раствором, центрифугируют,ресуспендируют в буферном разбавителе и стандартизируют по активности титрацией с бруцеллезной сывороткой. Способ получения бруцеллезного цветного антигена для РБП позволяет повысить активность целевого продукта, снизить себестоимость и продолжительность изготовления препарата.(72) Иванов Николай Петрович Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Бакиева Флюра Альбертовна Чалагизова Асель Сериковна Хусаинов Дамир Микдатович Амиргазиев Ералы Куанышбаевич(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ РОЗ БЕНГАЛ ПРОБЫ(57) Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано при производстве препаратов для диагностики бруцеллеза. 14639 Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано при производстве препаратов для диагностики бруцеллеза. Известен способ получения бруцеллезного цветного антигена для роз бенгал пробы (РБП), заключающийся в том, что чистую культуру штамма 19 выращивают в течение трех суток в четвертях на плотной питательной среде - печеночно-мартеновском агаре с добавлением перевара Хоттингера. Выросшую культуру бруцелл смывают стерильным 0,5 -ным фенолизированным физиологическим раствором и инактивируют в водяной бане при 80 С в течение 1 ч. Суспензию инактивированных клеток окрашивают 1-ным водным раствором краски бенгальской розовой,центрифугируют и ресуспендируют буферным разбавителем при перемешивании в течение 1 часа и ресуспендируют в буферном разбавителе, включающем едкий натр, фенолизированный физиологический раствор и молочную кислоту с последующей стандартизацией целевого продукта (Ветеринарные препараты / Справочник под ред. Д.Ф. Осидзе. М. Колос, 1981, с. 185-188). Однако этот способ не обеспечивает достаточного накопления бруцелл, является трудоемким, длительным, а сам цветной антиген не является достаточно эффективным, так как не содержит полного набора бруцеллезных антигенов. Задачей изобретения является разработка способа получения бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы (РПБ), обеспечивающего повышение активности антигена, снижение трудоемкости и длительности его получения. Способ получения бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы (РБП) включает культивирование штамма 19 на агаре, смыв бактериальных клеток фенолизированным физиологическим раствором, инактивирование полученной суспензии бактериальных клеток нагреванием, окрашивание ее розовым бенгальским, центрифугирование и ресуспендирование отделенной бактериальной массы буферным разбавителем с последующей стандартизацией целевого продукта, при этом дополнительно используют штаммы- и 61, культивирование штаммов 19,- и 61 осуществляют раздельно на эритритагаре с добавлением 0,02 цистина и 0,02 дрожжевого экстракта в течение 48 часов, инактивированные суспензии бактериальных клеток смешивают в соотношении 111, после чего окрашивают розовым бенгальским. Способ получения бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы осуществляется следующим образом. Пример. Бруцеллы штаммов-1,19 и 61 раздельно высевают на твердую питательную среду (эритрит-агар) с добавлением 0,02 цистина и 0,02 дрожжевого экстракта, помещенную в посевную четверть. Посев культуры производят путем увлаж 2 нения питательной среды посевным материалом,для чего используют 2-суточную агаровую культуру бруцелл. Засеянные четверти помещают в термостат при температуре 37 С на 48 часов. После окончания выращивания культуры смывают стерильным 0,5 -ным фенолизированным физиологическим раствором с рН 7,0-7,2 из расчета 35-50 мл на одну бутыль. Смытые культуры сливают в бутыли по 10 л, доводят концентрацию 0,5 ным раствором фенола до 180-220 млрд. м.к./см 2 и прогревают при 80 С в течение 60 минут. Прогретую суспензию проверяют на чистоту и стерильность путем микроскопии мазков, окрашенных по Грамму и Козловскому, и высева на МПБ, МПА,печеночно-мартеновский агар и бульон с переваром Хоттингера, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро - по две пробирки и два флакона с 50 мл бульона на каждый образец. За высевами наблюдают в течение 10 дней. После определения стерильности бактериальные суспензии штаммов-1,19 и 61 смешивают в соотношении 111, берут пробу и определяют необходимое количество краски бенгальской розовой. Суспензию бруцелл окрашивают 1 ным водным раствором краски бенгальской розовой в течение 24 ч при комнатной температуре. Суспензию окрашенных бруцелл центрифугируют с целью отделения бакмассы от избытка краски, фенолизированного физиологического раствора и остатков питательной среды и ресуспендируют буферным разбавителем при перемешивании в течение 1 часа. Полученный антиген стандартизируют по активности с национальной агглютинирующей бруцеллезной сывороткой, содержащей в 1 мл 1000 международных единицантител. Антиген считают активным и разрешают к выпуску, если он дает агглютинацию интенсивностью в 4 креста с сывороткой в разведении 110, содержащей 50 , 1,5-2 креста с сывороткой в разведении 120 (35 ) и отрицательную реакцию с сывороткой в разведении 135 (28,5 ). Если антиген отвечает указанным требованиям, приготовленную серию стерильно разливают во флаконы емкостью 20 мл. Флаконы с антигеном плотно закрывают резиновыми пробками и обкатывают металлическими колпачками, а затем просматривают в проходящем свете. Предложенный способ приготовления антигена позволяет получить 800 млрд. м.к./см 3, тогда как аналог позволяет получить 500 млрд. м.к./см 3. Соответственно количество полученного по предложенному способу стандартизированного роз бенгал антигена возрастает на 60 . Пластинчатую реакцию агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном применяют при исследовании сыворотки крови для диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, свиней, верблюдов и северных оленей. Сравнительные данные по существующему и предлагаемому способам изготовления единого бруцеллезного антигена приведены в табл. 1. Сравнительные данные по технологии получения антигена Существующий способ Штамм 19 Печеночно-мартеновский агар на переваре Хоттингера,расфасованный в посевные четверти. Выход антигена с 1 л питательной среды 0,7 л Культивирование в термостате при 37 С 72 часа Слив конденсата из четвертей Смыв культуры 0,5 фенолизированным физраствором Сбор культуры в 10 л стеклянные емкости Инактивация антигена в водяной бане или реакторе при 80 С 60 мин Окраска роз-бенгалом 500 млрд. м.к./см 3 200 мл роз бенгал антигена с одной четверти По данным табл. 1 видно, что предложенный способ получения антигена требует меньших затрат питательной среды, времени на изготовление и способствует получению большего количества роз бенгал антигена. Были проведены производственные испытания роз бенгал антигена, изготовленного по предлагаемой методике. Для сравнения использовали роз бенгал антиген, изготовленный по существующей методике. Для контроля сыворотку также исследовали в серологических реакциях реакции агглютинации(РА), реакции связывания комплемента (РСК). Исследования проводили на животных неблагополуч Предложенный способ Штаммы-1,19 и 61 Среда эритрит-агар с добавлением 0,02 цистина и 0,02 дрожжевого экстракта. Выход антигена с 1 л питательной среды 1,0 л Культивирование в термостате при 37 С 48 часов Нет Смыв культуры 0,5 фенолизированным физраствором Сбор культуры в 5-10 л стеклянные емкости Инактивация антигена в водяной бане или реакторе при 80 С 60 мин Окраска роз-бенгалом 800 млрд. м.к./см 3 320 мл роз бенгал антигена с одной четверти ных по бруцеллезу хозяйств, а также в благополучных хозяйствах. Всего было подвергнуто исследованию 726 голов крупного рогатого скота, 252 свиней, 778 мелкого рогатого скота. Полученные при этом данные приведены в табл. 2. Как видно из данных табл. 2, в результате проведенных испытаний установлена высокая активность и специфичность антигена в роз бенгал пробе, при этом значительное повышение чувствительности антигена наблюдали при диагностике бруцеллеза у овец и свиней (повышение выявляемости в среднем на 20 ). Таблица 2 Результаты испытания активности и специфичности предлагаемого роз бенгал антигена в сравнении с существующим Крупный скот Свиньи Мелкий скот Крупный скот Свиньи Мелкий скот Результаты исследования в роз бенгал пробе сущестпредл. вующ. 28 28 Благополучие хозяйства по бруцеллезу Количество исследованных проб сыворотки Предложенный способ получения бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы (РБП) позволяет повысить активность, снизить себестоимость и трудоемкость его получения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы (РБП), включающий культивирование штамма 19 на агаре, смыв бактериальных клеток фенолизированным физиологическим раствором, инактивирование полученной суспензии бактериальных клеток нагреванием, окрашивание ее розовым бенгальским, центрифугиро Результаты серологических реакций РА РСК 28 вание и ресуспендирование отделенной бактериальной массы буферным разбавителем с последующей стандартизацией целевого продукта, отличающийся тем, что дополнительно используют штаммы- и 61, культивирование штаммов 19,- и 61 осуществляют раздельно на эритрит-агаре с добавлением 0,02 цистина и 0,02 дрожжевого экстракта в течение 48 часов, инактивированные суспензии бактериальных клеток смешивают в соотношении 111, после чего окрашивают розовым бенгальским.