Способ изготовления единого бруцеллезного антигена для реакции агглютинации (ра), реакции связывания (длительного связывания) комплемента (рск, рдск)

(51) 61 39/10 (2006.01) 01 33/569 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ бруцеллезного антигена для выявления бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Способ изготовления единого бруцеллезного антигена путем культивирования штамма 19 на эритрит-агаре с добавлением экстракта дрожжей,гидролизата казеина,казеинового пептона,глюкозы,калия фосфорнокислого двузамещенного,калия фосфорнокислого однозамещенного, 4, О 4, 4, О 4,СоС 12, -глутаминовой кислоты, -цистеина лизина, -гистидина -аланина, -метионина,тиамина никотиновой кислоты пантотената кальция рибофлавина, пиридоксина, биотина,культивирование проводят в течение 48 часов при температуре 37 С, смывом культуры 0,01-ным раствором мертиолята, инактивацией при 80 С в течение 60 минут, титрацией антигена с доведением до титра в РА до 15 и РСК до 1150. Способ изготовления единого бруцеллезного антигена позволяет повысить активность целевого продукта,снизить себестоимость и продолжительность изготовления препарата.(72) Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Хусаинов Дамир Микдатович Шанбаев Бакдаулет Унербекович Алимбекова Меруерт Ерболатовна збеков Марлен Болатжанлы Исаева Асем Амануллаевна Баязерова Татьяна Керимовна Сапаров Аян Анаркулович Маукеев Куаныш Абылкасымович(56) Касьянов А.Н., Сапегина Е.П. Получение единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК // Ветеринария, 1973, 10, с.50-52(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЕДИНОГО БРУЦЕЛЛЕЗНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ (РА), РЕАКЦИИ СВЯЗЫВАНИЯ Изобретение относится к ветеринарии, а именно к технологии производства единого бруцеллезного антигена для выявления бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Известен способ изготовления единого бруцеллезного антигена для реакции агглютинации(РА), реакции связывания (длительного связывания) комплемента (РСК, РДСК) путем культивирования штамма 19 на плотной питательной среде, отделения бактериальных клеток, их инактивацию, ресуспендирование в физиологическом растворе, определение активности, при этом культивирование осуществляют на печеночномартеновский агаре на переваре Хоттингера в течение 72 часов, смыв осуществляют фенолизированным физиологическим раствором,а определение активности целевого продукта проводят путем подсчета концентрации микробных клеток(Касьянов А.Н Сапегина Е.П. Получение единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК // Ветеринария, 1973, 10, с.50-52). Однако этот способ не обеспечивает достаточного накопления бруцелл,является трудоемким,длительным. Задачей является разработка способа изготовления единого бруцеллезного антигена для реакции агглютинации (РА), реакции связывания (длительного связывания) комплемента(РСК,РДСК),обеспечивающего повышение активности целевого продукта,снижение себестоимости и продолжительности изготовления препарата. Это достигается путем культивирования на среде,содержащей эритрит-агар с добавлением, мас. 0,0180,022 экстракта дрожжей, 0,008-0,012 гидролизата казеина 0,16-0,2 казеинового пептона 0,18-0,22 глюкозы 0,018-0,022 калия фосфорнокислого двузамещенного 0,018-0,022 калия фосфорнокислого однозамещенного 0,003-0,005 4 0,0005-0,0015 4 0,003-0,005 4 0,0005-0,0015 4 0,0005-0,0015 12 0,005 - 0,015 -глутаминовой кислоты, 0,005-0,015 -цистеина 0,005-0,015 лизина, 0,005-0,015 -гистидина 0,005-0,015 аланина, 0,005-0,015 -метионина, 0,0001-0,0002 тиамина 0,0001-0,0002 никотиновой кислоты 0,00010,0002 пантотената кальция 0,0001-0,0002 рибофлавина, 0,0001-0,0002 пиридоксина, 0,00000010,0000002 биотина, культивирование проводят в течение 48 часов при температуре 37 С, с последующим смывов культуры 0,01-ным раствором мертиолята, инактивацией при 80 С в течение 60 минут, титрацией антигена с доведением до необходимого титра. Способ изготовления единого бруцеллезного антигена для реакции агглютинации (РА), реакции связывания (длительного связывания) комплемента(РСК, РДСК) осуществляется следующим образом. Пример. Вакцинный штамм бруцелл вида 19 высевают на плотную питательную среду(эритрит-агар) с добавлением, мас. 0,02 экстракта дрожжей 0,01 гидролизата казеина 0,18 казеинового пептона 0,2 глюкозы 0,02 калия фосфорнокислого двузамещенного 0,02 калия фосфорнокислого однозамещенного 0,004 4 0,001 4 0,004 2 4 0,001 4 0,001 12 0,01 глутаминовой кислоты, 0,01 -цистеина 0,01 лизина, 0,01 -гистидина 0,01 -аланина, 0,01 метионина, 0,00015 тиамина 0,00015 никотиновой кислоты 0,00015 пантотената кальция 0,00015 рибофлавина, 0,00015 пиридоксина, 0,00000015 биотина, помещенную в посевную четверть или другую посуду. Посев культуры производят путем увлажнения питательной среды посевным материалом,для чего используют 2-суточную агаровую культуру бруцелл. Засеянные четверти помещают в термостат при температуре 37 С на 48 часов. После окончания выращивания культуру смывают стерильным 0,01-ным мертиолятным физиологическим раствором с 7,0-7,2 из расчета 35-50 см 3 на одну бутыль. Смытую культуру сливают в бутыли по 10 дм 3 и прогревают при 80 С в течение 60 минут. Прогретую суспензию проверяют на чистоту и стерильность путем микроскопии мазков, окрашенных по Грамму и Козловскому, и высева на МПБ, МПА,печеночно-мартеновский агар и бульон с переваром Хоттингера, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро по две пробирки и два флакона с 50 см 3 бульона на каждый образец. За высевами наблюдают в течение 10 дней. Активность антигена в реакции агглютинации (РА) стандартизируют по национальной стандартной агглютинирующей сыворотке антибруцелла абортус,содержащей в 1 см 3 1000 международных единицантител. Содержимое ампулы(сухую стандартную сыворотку) растворяют дистиллированной водой, а затем разводят 0,01-ным мертиолятным физиологическим раствором 1150, 1200, 12540, 1300 и 1350. Полученные разведения сыворотки хранят в стерильных флаконах. Концентрат антигена разводят 0,01-ным мертиолятным физиологическим раствором 13 13,5 14 и т. д. до 116. Каждое разведение антигена испытывают со всеми пятью разведениями стандартной сыворотки при одинаковой дозировке ингредиентов, равной 0,5 см 3. При этом после добавления антигена к сыворотке в каждой пробирке будет по 1 см 3 смеси,соответствующей конечным разведениям сыворотки 1300, 1400, 1500, 1600, 1700. Одновременно антиген испытывают с негативной сывороткой в разведении 125, 150 и 0,01-ным мертиолятным физиологическим раствором. Пробирки встряхивают, выдерживают в термостате при температуре 37 С в течение 23 ч и затем при комнатной температуре 1 ч. Реакцию агглютинации учитывают в соответствии с наставлением по постановке и учету РА при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных. При учете определяют то разведение антигена,которое с конечным разведением стандартной сыворотки 1500 дает 50 агглютинации . С негативной сывороткой и физиологическим раствором реакции должны быть отрицательными. В зависимости от результатов титрации концентрированную суспензию разводят стерильным 0,01-ным мертиолятным раствором и тщательно смешивают. Отбирают пробу и ставят РА с разведениями антигена 14,5 15 15,5. Антиген в разведении 15 с конечным разведением стандартной агглютинирующей сыворотки 1500 должен дать 50 агглютинации. Активность антигена в реакции связывания комплемента (РСК) определяют титрованием по квадратной схеме со стандартной бруцеллезной агглютинирующей сывороткой в разведениях 1100,1125, 1150, 1175, 1200. Одновременно антиген испытывают с негативной сывороткой в разведениях 15 и 110. Антиген (стандартизированную в РА взвесь бруцелл) разводят 150, 1100, 1150, 1200, 1300. 1400. Комплемент и гемолизин берут в рабочих титрах, эритроциты - 2,5 от осадка. Сыворотку инактивируют 30 минут при температуре 58-60 С. Предельным титром антигена считают то его разведение, которое дает полную задержку гемолиза с наибольшим разведением стандартной бруцеллезной сыворотки. За рабочий титр антигена в РСК принимают двойную дозу его предельного титра. Антиген выпускают, если в РА его разведение 15 с конечным разведением стандартной бруцеллезной сыворотки 1500 дает 50 агглютинациив РСК дает полную задержку гемолиза со стандартной бруцеллезной сывороткой в ее предельном титре при разведении антигена не ниже, чем 1150. Таблица 1 Сравнительные данные по технологии получения антигена Существующая (прототип) технология получения Предлагаемая технология (новый) получения Печеночно-мартеновский агар на переваре Хоттингера, Среда эритрит-агар с добавлением, масс. 0,018-0,022 расфасованный в посевные четверти. Выход антигена с экстракта дрожжей, 0,008-0,012 гидролизата казеина 1 дм 3 питательной среды 0,7 дм 3 0,16-0,2 казеинового пептона 0,18-0,22 глюкозы 0,0180,022 калия фосфорнокислого двузамещенного 0,0180,022 калия фосфорнокислого однозамещенного 0,003 0,005 4 0,0005 - 0,0015 4 0,003 - 0,005 4 0,0005 - 0,0015 4 0,0005 - 0,0015 12 0,005 0,015 -глутаминовой кислоты, 0,005 - 0,015 -цистеина 0,005 - 0,015 -лизина, 0,005 - 0,015 -гистидина 0,005 0,015 -аланина, 0,005 - 0,015 - метионина, 0,00010,0002 тиамина 0,0001- 0,0002 никотиновой кислоты 0,0001-0,0002 пантотената кальция 0,0001-0,0002 рибофлавина, 0,0001-0,0002 пиридоксина, 0,00000010,0000002 биотина 3. Выход антигена с 1 дм 3 питательной среды 1,0 дм 3 Культивирование в термостате при 37 С 72 часа Культивирование в термостате при 37 С 48 часов Слив конденсата из четвертей Нет Смыв культуры 0,5 фенолизированным физраствором Смыв культуры 0,01-ным мертиолятным физраствором Сбор культуры Сбор культуры Инактивация антигена в водяной бане или реакторе при Инактивация антигена в водяной бане или реакторе при 80 С 60 мин 80 С 60 мин Доведение концентрации до 30 млн. м.к. Титрация и доведение титра до 15 в РА и до 1150 в РСК ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ изготовления единого бруцеллезного антигена для реакции агглютинации (РА), реакции связывания (длительного связывания) комплемента(РСК, РДСК), включающий культивирование штамма Вг 19 на плотной питательной среде,отделение бактериальных клеток, их инактивацию,суспендирование в физиологическом растворе,определение активности целевого продукта,отличающийся тем, что культивирование проводят на эритрит-агаре с добавлением, мас. 0,018-0,022 экстракта дрожжей, 0,008-0,012 гидролизата казеина,0,16-0,2 казеинового пептона, 0,18-0,22 глюкозы,0,018-0,022 калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,018-0,022 калия фосфорнокислого однозамещенного,0,003-0,005 4, 0,0005-0,0015 4, 0,003-0,005 4, 0,0005-0,0015 4, 0,0005-0,0015 СоС 12,0,005-0,015 -глутаминовой кислоты, 0,005-0,015 цистеина, 0,005-0,015 -лизина, 0,005-0,015 гистидина, 0,005-0,015 -аланина, 0,005-0,015 метионина, 0,0001-0,0002 тиамина, 0,0001-0,0002 никотиновой кислоты, 0,0001-0,0002 пантотената кальция 0,0001-0,0002 рибофлавина, 0,0001-0,0002 пиридоксина,0,0000001-0,0000002 биотина,культивирование осуществляют в течение 48 часов,смыв осуществляют мертиолятным физиологическим раствором, а определение активности и концентрации целевого продукта проводят путем титрации в РА и РСК.