Способ изготовления антигена для диагностики инфекционного эпидидимита баранов

(51) 61 39/10 (2006.01) 01 33/569 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ фосфорнокислого двузамещенного,калия фосфорнокислого однозамещенного, 4, 4,4, 4, СС 12, -глутаминовой кислоты,-цистеина -лизина, -гистидина -аланина,-метионина, тиамина никотиновой кислоты пантотената кальция рибофлавина, пиридоксина,биотина, культивирован проводят в течение 48 часов при температуре 37 С, с последующим смывов культуры физиологическим раствором с рН 7,2, доведением концентрации бруцелл до 1 млрд.КОЕ/см 3, с последующей инактивацией бакмассы на водяной бане при 70-80 С 1-2 часа,после инактивации бактериальной взвеси добавляют раствор 0,05 М триса подвергают воздействию с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1,УЗДН-2 или другого при частоте 22-35 кГц,мощности 70-90 Вт/см 3 ультразвуковых волн до просветления в течение 3040 мин, затем микробный дезинтеграт центрифугируют при 18000-20000 об/мин в течение 30 мин, затем надосадочную жидкость сливают, консервируют мертиолятом до 0,01 концентрации и получают целевой продукт. Способ изготовления антигена для диагностики инфекционного эпидидимита баранов позволяет снизить себестоимость и продолжительность изготовления препарата.(72) Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Хусаинов Дамир Микдатович Шанбаев Бакдаулет Унербекович Алимбекова Меруерт Ерболатовна збеков Марлен Болатжанлы Исаева Асем Амануллаевна Баязерова Татьяна Керимовна Сапаров Аян Анаркулович Маукеев Куаныш Абылкасымович(56) Иванов Н.П. Препараты, применяемые при бруцеллезе животных в Казахстане. Алматы, 2005(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО ЭПИДИДИМИТА БАРАНОВ(57) Изобретение относится к ветеринарии, а именно к технологии производству антигена для диагностики инфекционного эпидидимита баранов. Способ изготовления антигена для диагностики инфекционного эпидидимита баранов путем культивирования бруцелл видана среде, содержащей эритрит-агар с добавлением экстракта дрожжей,гидролизата казеина,казеинового пептона,глюкозы,калия Изобретение относится к ветеринарии, а именно к технологии производства антигена для диагностики инфекционного эпидидимита баранов. Известен способ изготовления антигена для диагностики инфекционного эпидидимита баранов путем выращивания бруцелл видана эритрит-агаре последующим смывом клеток,обработкой их ультразвуком при частоте 22-35 КГц интенсивности 70-90 Вт/см 3 в течение 30-40 мин,центрифугированием микробного дезинтеграта и отделением целевого продукта (Иванов Н.П. Препараты, применяемые при бруцеллезе животных в Казахстане. Алматы, 2005). Однако этот способ не обеспечивает достаточного накопления бруцелл,является трудоемким, длительным. Задачей является разработка способа изготовления антигена для диагностики инфекционного эпидидимита баранов,обеспечивающего повышение активности целевого продукта,снижение себестоимости и продолжительности изготовления препарата. Это достигается путем культивирования бруцелл видана среде, содержащей эритритагар с добавлением, мас. 0,018-0,022 экстракта дрожжей, 0,008-0,012 гидролизата казеина 0,16-0,2 казеинового пептона 0,18-0,22 глюкозы 0,018-0,022 калия фосфорнокислого двузамещенного 0,0180,022 калия фосфорнокислого однозамещенного 0,003-0,005 4 0,0005-0,0015 4 0,003-0,005 4 0,0005-0,0015 4 0,0005-0,0015 12 0,005-0,015 -глутаминовой кислоты, 0,005-0,015 цистеина 0,005-0,015 -лизина, 0,005-0,015 гистидина 0,005-0,015 аланина, 0,005-0,015 метионина, 0,0001-0,0002 тиамина 0,0001-0,0002 никотиновый кислоты 0,0001-0,0002 пантотената кальция 0,0001-0,0002 рибофлавина, 0,0001-0,0002 пиридоксина,0,0000001-0,0000002 биотина,культивирование проводят в течение 48 часов при температуре 37 С, с последующим смывов культуры физиологическим раствором с рН-7,2,доведением концентрации бруцелл до 100 млрд.КОЕ/см 3, с последующей инактивацией бакмассы на водяной бане при 70-80 С 1-2 часа,после инактивации бактериальной взвеси добавляют раствор 0,05 М триса и подвергают воздействию помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1,УЗДН-2 или другого при частоте 22-35 кГц,мощности 70-90 Вт/см 3 ультразвуковых волн до просветления в течение 3040 мин затем микробный дезинтеграт центрифугируют при 18000-20000 об/мин в течение 30 мин, затем надосадочную жидкость сливают, консервируют мертиолятом до 0,01 концентрации и получают целевой продукт. Способ изготовления антигена для диагностики инфекционного эпидидимита баранов осуществляется следующим образом. Пример. Бруцеллы вида овис, например штамм 424/2, или другие виды бруцелл вида овис высевают на плотную питательную среду казеинового пептона 0,2 глюкозы 0,02 калия фосфорнокислого двузамещенного 0,02 калия фосфорнокислого однозамещенного 0,004 4 0,001 4 0,004 4 0,001 4 0,001 12 0,01 -глутаминовой кислоты, 0,01-аланина, 0,01 -метионина, 0,00015 тиамина 0,00015 никотиновой кислоты 0,00015 пантотената кальция 0,00015 рибофлавина,0,00015 пиридоксина, 0,00000015 биотина, помещенную в посевную четверть или другую посуду. Посев культуры производят путем увлажнения питательной среды посевным материалом, для чего используют 2-суточную агаровую культуру бруцелл. Засеянные четверти помещают в термостат при температуре 37 С на 48 часов. После окончания выращивания культуру смывают физиологическим раствором с рН-7,2,доводят концентрацию бруцелл до 100 млрд.КОЕ/см 3 взвесь с последующей инактивацией бакмассы на водяной бане при 7080 С 1-2 часа, после инактивации бактериальной взвеси добавляют раствор 0,05 М триса и подвергают воздействию с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1, УЗДН-2 или другого при частоте 22-35 кГц, мощности 70-90 Вт/см 3 ультразвуковых волн до просветления в течение 3040 мин, затем микробный дезинтеграт центрифугируют при 18000-20000 об/мин в течение 30 мин, затем надосадочную жидкость сливают,консервируют мертиолятом до 0,01 концентрации и получают целевой продукт. Приготовленный антиген разливают в стерильных условиях во флаконы объемом от 2,0 до 20,0 см 3 из нейтрального стекла, закупоривают резиновыми пробками и затыкают металлическими колпачками. Сравнительные данные по существующему и предлагаемому способам изготовления антигена приведены в табл. 1 Специфичность овисного антигена определяют в лабораторных условиях. Реакцию длительного связывания комплемента с овисным антигеном проводят в чистых сухих стеклянных пробирках Флоринского. На наружной стенке пробирки указывают номер испытуемой пробы сывороток крови. Реакцию ставят на 0,85-ным физиологическом растворе в разведении антигена 1100. При каждой постановке реакции одновременно с испытуемыми пробами ставят контроли с негативной и позитивной овисной сыворотками в разведениях 15. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в крестах. За диагностический титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем в 2 креста. Контролем служат заведомо отрицательная и положительная овисная пробы сывороток крови животных. При изучении специфичность предложенного овисного антигена в сравнении с биофабричным(РДСК) подвергают исследованию поливалентные сыворотки против бруцелл других видов,салмонелл, лептосир, пастерелл, энтерекокка,кампилобактерий При этом во всех случаях получают отрицательный результат,что свидетельствует о специфичности приготовленного антигена. Специфичность и чувствительность реакцию длительного связывания комплемента разработанным антигеном в сравнении общепринятым методом (РДСК с биофабричным овисным антигеном) изучают также путем исследования 78 сывороток крови баранов из различных по эпизоотическому состоянию ферм. Результаты серологических реакций при исследовании сывороток крови баранов на инфекционный эпидидимит, показаны в таблице 2. Из таблицы 2 видно, что все благополучные по бруцеллезу группы животных имеют отрицательные показания по РДСК как с биофабричным антигеном,так и разработанным антигеном, а при исследовании на инфекционный эпидидимит 44 проб сыворотки крови баранов из неблагополучных хозяйств положительные результаты получены в РДСК с биофабричным антигеном в 8 случаях, а одна проба дала сомнительный результат, с разработанным овисным антигеном в РДСК 9 случаев дали положительный результат. Использование предложенного способа позволит снизить время на изготовление антигена и будет способствовать получению большего количества антигена с высокой активностью и специфичностью. Таблица 1 Сравнительные данные по технологии получения антигена Существующая (прототип) технология получения Эритрит агар. Среда эритрит-агар с добавлением, масс. 0,018-0,022 экстракта дрожжей, 0,008-0,012 гидролизата казеина 0,160,2 казеинового пептона 0,18-0,22 глюкозы 0,018-0,022 калия фосфорнокислого двузамещенного 0,018-0,022 калия фосфорнокислого однозамещенного 0,003 - 0,005 4 0,0005-0,0015 4 0,003-0,005 4 0,0005-0,0015 4 0,0005-0,0015 12 0,005-0,015 -глутаминовой кислоты, 0,005-0,015 -цистеина 0,005 - 0,015 -лизина,0,005-0,015 -гистидина 0,005-0,015 -аланина, 0,005-0,015-метионина, 0,0001-0,0002 тиамина 0,0001-0,0002 никотиновой кислоты 0,0001-0,0002 пантотената кальция 0,0001-0,0002 рибофлавина, 0,0001-0,0002 пиридоксина,0,0000001-0,0000002 биотина 3. Культивирование в термостате при 37 С 72 часа Культивирование в термостате при 37 С 48 часов Слив конденсата из четвертей Нет Смыв культуры Смыв культуры Выход взвеси бруцелл с 1 дм 3 питательной Выход взвеси бруцелл с 1 дм 3 питательной среды 1,0 дм 3 3 среды 0,7 дм Обработка бруцелл ультразвуком при частоте Обработка бруцелл ультразвуком при частоте 22-35 КГц и 22-35 КГц и интенсивности 70-90 Вт/см 3 в интенсивности 70-90 Вт/см 3 в течение 30-40 мин течение 30-40 мин Центрифугирование микробного дезинтеграта Центрифугирование микробного дезинтеграта при 18000 при 18000-20000 об/мин в течение 30 мин, слив 20000 об/мин в течение 30 мин, слив надосадочную надосадочную жидкости, консервирование жидкости, консервирование мертиолятом до 0,01 фенолом до 0,5 концентрации и получение концентрации и получение целевого продукта. целевого продукта. Выход с 1 дм 3 питательной среды 0,7 дм-3 Выход с 1 дм 3 питательной среды 1,0 дм 3 целевого целевого продукта продукта Таблица 2 Результаты исследований сывороток на инфекционный эпидидимит баранов Количество исследованных проб сывороток Результаты исследования РДСК с биофабричным РДСК с разработанным овисным антигеном овисным антигеном Полож Сомн Отриц Полож Сомн Отриц 44 44 8 1 56 9 56 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ изготовления единого бруцеллезного антигена для диагностики инфекционного эпидидимита баранов,включающий культивирование бруцелл вида Вна эритрит-агаре с последующим смывом клеток,обработкой их ультразвуком при частоте 22-35 КГц и интенсивности 70-90 Вт/см 3 в течение 30-40 мин,центрифугированием микробного дезинтеграта и отделением целевого продукта, отличающийся тем, что культивирование проводят на эритритагаре с добавлением, мас. 0,018-0,022 экстракта дрожжей, 0,008-0,012 гидролизата казеина, 0,16-0,2 казеинового пептона, 0,18-0,22 глюкозы, 0,018-0,022 калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,0180,022 калия фосфорнокислого однозамещенного,0,003-0,005 4, 0,0005-0,0015 4, 0,003-0,005 4, 0,0005-0,0015 4, 0,0005-0,0015 СоС 12,0,005-0,015 -глутаминовой кислоты, 0,005-0,015 цистеина, 0,005-0,015 -лизина, 0,005-0,015 гистидина, 0,005-0,015 -аланина, 0,005-0,015 метионина, 0,0001-0,0002 тиамина, 0,0001-0,0002 никотиновой кислоты, 0,0001-0,0002 пантотената кальция 0,0001-0,0002 рибофлавина, 0,0001-0,0002 пиридоксина,0,0000001-0,0000002 биотина,культивирование осуществляют в течение 48 часов,а целевой продукт консервируют мертиолятом до 0,01 концентрации.