Штамм бактерии salmonella dublin b – 0284, используемый для приготовления сухой живой вакцины против сальмонеллеза телят

(51) 61 39/112 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области ветеринарии,в частности ветеринарной микробиологии и представляет собой штаммВ 0284 15 , используемый для приготовления сухой живой вакцины против сальмонеллеза телят. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в выражается в изыскании аттенуированного безвредного и иммуногенного штамма. Штамм бактерииВ - 0284 15 ,используемый для приготовления сухой живой вакцины против сальмонеллеза телят, депонирован в Лаборатории генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно исследовательский ветеринарный институт (КазНИВИ).(72) Егорова Наталья Николаевна Мусаева Асия Кыблашевна Даугалиева Аида Тлековна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) ШТАММ БАКТЕРИИ- 0284, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ СУХОЙ ЖИВОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ТЕЛЯТ Изобретение относится к области ветеринарии, в частности ветеринарной микробиологии и представляет собой аттенуированный штамм, используемый для приготовления сухой живой вакцины против сальмонеллеза телят. Известен аттенуированный штамм бактерий 6 , используемый для получения живой вакцины против сальмонеллеза телят Ветеринарные препараты в России. Справочник,том 2/М. Сельхозиздат,2004. с.177-178. Производитель Диавак,Московская обл.,Серпуховский -он, пос. Оболенск. Известный штамм бактерий 6 не обладает высокой иммуногенной активностью и сообщает телятам иммунитет продолжительность только 6 месяцев. Задачей данного изобретения является получение аттенуированного со слабой остаточной вирулентностью и высокой иммуногенной активностью штамма. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в выражается в изыскании аттенуированного безвредного и иммуногенного штамма. Штамм бактерийВ - 0284 15 депонирован в ТОО Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(КазНИВИ), используемый для приготовления сухой живой вакцины против сальмонеллеза телят. Идентификацию штамма бактерий проводят по основным культурально-морфологическим,биохимическим и антигенным свойствам, согласно определителю/,2005,2,, .764-799. Селекция штамма. ШтаммВ 0284 15 выделен из из печени 5-ти месячного теленка, павшего от сальмонеллеза, принадлежащей СХПК ПЗ Алматы Талгарского района Алматинской области. Печеночную ткань засевали пастеровской пипеткой в мясопептонный бульон (МПБ). Посевы культивировали в термостате при 37 С 18-20 часов. Отмечалось равномерное помутнение МПБ. Затем с МПБ делали посевы на висмут-сульфитный агар,среду Эндо и на (мясопептонный агар) МПА. При посеве отдельных колоний сальмонелл, выделенных с МПА на чашках Петри, отмечалось, что при пересеве в МПБ при 20 часах инкубации и дальнейшем пересеве в одинаковой дозировке 1 см 3 на 10,0 см 3 МПБ отмечалось неодинаковое накопление бакмассы. Значительная временная разница в интенсивности роста культур указывала на неоднородность популяциипо своей репродуктивной активности. Исходя из результатов исследований, в целях получения однородного популяционного свойства бактерий,обладающих сравнительно короткой лагфазой,сопровождающейся накоплением более высокой бактериальной массы,были проведены исследования по селекции отдельных колоний штамма сальмонелл с активными ростовыми репродуктивными свойствами. После отбора активных клоновкультуру высевали на МПА с добавлением возрастающих концентраций стрептомицина в разведениях 125, 1 50, 1100, 1150, 1200, 1250,1300 мкг/см 3. Культуру выращивали на МПА с постепенно возрастающими концентрациями стрептомицина. Путем селекции штаммана МПА при концентрации антибиотика(1250 мкг/см 3) путем ступенчатого отбора колоний получен аттенуированный (ослабленный) штамм,выращенный при максимальной концентрации стрептомицина. Методом разведений выделяли аттенуированные клоны сальмонелл, выросших на чашках Петри с МПА со стрептомицином, которые при последующем посеве в пробирки с МПБ давали наиболее обильный рост. Накопление бактериальной массы сальмонелл определяли по 1 миллиардному оптическому сальмонеллезному бактериальному стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Селекционное выделение клонов сальмонелл,отличающихся по скорости репродукции и выросших на МПА с концентрацией стрептомицина 1250 мкг/см 3,проводили последовательно двукратно,затем клоны размножали и после этого изучали их активность по наибольшему накоплению бактериальной массы и активности роста на средах с добавлением стрептомицина. Стрептомицин ослабил вирулентные свойства эпизоотического штамма в 20 раз. В результате проведенного клонирования был выделен изолят 15 из популяции штамма, который был выбран для дальнейшей работы, так как за 18 часов культивирования в термостате на МПБ с добавлением 1300 мкг/см 3 стрептомицина накопление бактериальной массы составляло более 3 миллиардов микробных клеток в 1 см 3 МПБ. У остальных клонов этот показатель был несколько ниже (около 1 млрд м. к. /см 3). При повторной проверке выбранного штамма(изолят 15) через 3 месяца после хранения на полужидком агаре под вазелиновым маслом под резиновыми парафинированными пробками была установлена стабильность клона в быстроте роста на средах, что указывало на целесообразность его использования при проведении дальнейших исследований по отбору штамма для изготовления вакцинного препарата. Изолят 15 был условно обозначен штаммомВ-0284 15 ,который депонирован в коллекции культур микроорганизмов ТОО Научно-исследовательский ветеринарный институт. Морфологические признаки.В 0284 15- палочки с закругленными краями, реже овоидной формы, 2-4 мкм в длину и 0,2-0,4 мкм в ширину. Сальмонеллы подвижные,с перитрихиально расположенными жгутиками, легко окрашиваются анилиновыми красками,грамотрицательные. Спор и капсул не образуют.являются мелкими по размеру по сравнению с другими видами сальмонелл. Культуральные свойства. Сальмонеллы - аэробы или факультативные аэробы. Хорошо развиваются на обычных питательных средах, оптимальная температура роста 37 С, присреды 7,2-7,4. На МПБВ-0284 15 образует равномерное помутнение со слизистым осадком, на МПА серовато-голубоватые мелкие опалесцирующие колонии, вокруг которых иногда образуются периферические валики. При хранении культуры довольно быстро диссоциируют вформу. На среде Эндо сальмонеллы образуют слегка розоватые прозрачные колонии на висмут сульфитном агаре мелкие черные колонии с металлическим блеском, участки среды под колонией также окрашиваются в черный цвет на среде Плоскирева - бесцветные колонии. На среде Клиглера сальмонеллы растут в виде мелких колоний ярко желтого цвета. Для культивирования сальмонелл используют также среды накопления селинитовую, Мюллера, Кауфмана, Киллиана. Учет характера роста необходимо проводить через 24 - 48 часов. Биохимические свойства. ШтаммВ-0284 15 не изменяет инозит, глицерино фуксиновый бульон, раффинозу, салицин образует сероводород и продуцирует индол. Не ферментирует мочевину, лактозу, сахарозу, не разлагает желатин. Ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, галактозу, маннозу,арабинозу, рамнозу, маннит, мальтозу, дульцит,сорбит, восстанавливает нитраты в нитриты. Сальмонеллы растут на агаре Симмонса(желтое окрашивание среды). Антигенная структура. УВ 0284 15 имеется два основных антигенных комплекса О антиген(соматический) термостабильный, Н - антиген (термолабильный),белковой природы. О антиген- 1, 9, 12, Н- , (1-я фаза). О- и Н- антигены вызывают образование различных антител, отличающихся по характеру агглютината. О - агглютинация мелкозернистая,клетки соединяются полярными поверхностями,образуя мелкие агрегаты. Н - агглютинация характеризуется образованием хлопьевидного рыхлого агглютината, клетки соединяются своими жгутиками, происходит полное обездвиживание сальмонелл.В-0284 15 относится к серологической группе Д. Для идентификации сальмонелл путем иммунизации кроликов готовят монорецепторные сыворотки к каждому антигену (например, к О антигенам 1,9, 12 и т. д. и Н - антигенам , и др).Сначала определяют 9 по О - антигену групповую принадлежность сальмонелл (реакция агглютинации на стекле), затем при помощи Н монорецепторных сывороток устанавливают типовую принадлежностью Знание антигенной структуры сальмонелл необходимо при отборе штаммов в процессе конструирования вакцин. ШтаммВ-0284 15 является аттенуированным (ослабленным) вакцинным, не реактогенным,не обладает абортогенными свойствами для суягных овцематок. Штамм обладает слабой остаточной вирулентностью. За время хранения в лабораторных условиях штамм не изменил культурально-морфологические,биохимические свойства, также антигенную структуру. Маркерные признаки штаммаВ-0272 -5. ШтаммВ-0284 15 , полученный из вирулентной эпизоотической культуры под влиянием химического мутагенастрептомицина с последующей селекцией мутантов,отличается слабой остаточной вирулентностью,безвредностью,выраженной иммуногенной активностью, отсутствием токсигенных свойств. Образовывает сероводород, не продуцирует индол,не ферментирует лактозу и сахарозу. Маркерным признаком является продукция сероводорода. Является прототрофом. Существенным отличием штаммаВ-0284 15 от вирулентного прототипа является ауксотрофность в отношении тиамина и никотиновой кислоты штамм образует аргинин - декарбоксилазу и слабо- лизиндекарбоксилазу. Вакцинный штамм не реверсирует при пассировании на восприимчивых животных(белые мыши). Штамм растет на средах с добавлением высоких концентраций стрептомицина, природные эпизоотические изоляты не растут, стрептомицин подавляет их рост. Титр сыворотки в РА 1800. Физиологические - прототроф, хемоорганотроф,обладает дыхательным и бродильным типом метаболима. Аэроб. Серологические при типизации с диагностическими сальмонелезными сыворотками имеет постоянную реакцию с О - сывороткой 1, 9,12 и Н -, сыворотками - с (1-я фаза). Патогенные свойства. ШтаммВ-0284 15 безвреден для белых мышей. При внутрибрюшинном введении белым мышам массой 16-18 г 50 млн микробных клеток (0,2 см 3 250 млн взвеси суточной агаровой культуры сальмонелл) по оптическому стандартному образцу ГИСК им. Тарасевича в объеме 0,2 см 3 вызывает гибель не более 2 белых мышей из 10 в течение 10 сут наблюдения. Иммуногенность для белых мышей. ШтаммВ-0284 15 обладает выраженной иммуногенностью для белых мышей массой 16 - 18 граммов,защищая 100 животных при однократной подкожной иммунизации их живой вакциной из штаммаВ-0284 15 в дозе 10 млн микробных клеток в объеме 0,2 см 3 и последующим подкожным заражением через 21 сутки 2,5 50 смывом суточной агаровой культуры вирулентного (контрольного) штамма 373. Выживаемость опытных животных составила 100 - 10 голов. Из 10 контрольных мышей аналогичной массы,зараженных одновременно с вакцинированными, погибли 8 животных. Срок наблюдения 10 суток. Пример. Питательной средой для изготовления сухой живой вакцины против сальмонеллеза телят 3 служит бульон Хоттингера (200-250 мг аминного азота), содержащий 10 печеночного экстракта,0,4 пептона. Для приготовления питательной среды используют основной перевар Хоттингера. На 1 кг мясного фарша добавляют 1,5 дм 3 дистиллированной воды, подогретой до 40 С, и подщелачивают 20 раствором едкого натра, так чтобы концентрация водородных ионов была 7,8 8,0. Затем на каждый килограмм фарша добавляют 150-170 г измельченной поджелудочной железы или 18-20 г панкреатина и на каждый дм 3 смеси - 10 см 3 хлороформа. Ферментативное расщепление должно продолжаться 5-6 сут при 40-45 С. Химические показатели качественного перевара общий азот 800-1200 мг аминный азот -500-750 мг триптофан - 100 150 мг. Содержание (мг) общего азота определяют методом перегонки Къельдаля аминного азота (мг) - формольным титрованием триптофана (мг) - методом Пешкова. Приготовление печеночного экстракта. На 400,0 г свежей или свежезамороженной печени крс или свиней, освобожденной от жира и пленок,измельченной на кусочки по 30,0-50,0 г, добавляют 0,5 дм 3 дистиллированной воды и кипятят в течение часа, после чего фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Приготовление питательной среды. Для приготовления питательной среды к надосадочной жидкости основного перевара Хоттингера добавляют дистиллированную воду с таким расчетом, чтобы содержание аминного азота было не менее 200-250 мг. Затем добавляют 10 печеночного экстракта, 0,4 пептона, 3-4 агара. Смесь кипятят в течение 30 минут, затем устанавливаютсреды до 7,7-7,8 путем добавления 20 едкого натра, добавляют 15 дистиллированной воды на выкипание, после чего добавляют 0,3 химически чистого хлорида натрия. После растворения указанных ингредиентов добавлением 20 едкого натра устанавливают 7,8-9,0. Среду кипятят 30 минут, отстаивают 1-1,5 часа, фильтруют через ватно - марлевый фильтр. Для контроля стерильности приготовленную питательную среду выдерживают термостате 72 часа при 37 С (отсутствие контаминации). Готовая питательная среда должна быть стерильной,прозрачной или слегка опалесцирующей,7,4-7,6 и содержать аминный азот 200-250 мг. Приготовление посевного материала. Для изготовления сухой живой вакцины против сальмонеллеза телят каждый раз используют отдельную ампулу с лиофилизированной культурой штаммаВ-0284 15 . Каждый раз проверяют морфологические,культуральные,биохимические свойства и агглютинабельность штамма с монорецепторными сальмонеллезными сыворотками О-, , , Н - , производства Краснодарской биофабрики и СанктПетербургского научноисследовательского института вакцин и сывороток и предприятия по 4 агглютинируются сыворотками О -//, Х//,Х//, Н - , //. Ампулу с сухим штаммом вскрывают и добавляют в нее 2 см 3 стерильного физиологического раствора. Полученную взвесь заливают по 1 см 3 в два флакона с бульоном Хоттингера (вместимость флакона 100 см 3, объем среды - 1/3 флакона). Выращивают в термостате 14 15 часов при температуре (371,0)С (культура первой генерации). Культуру первой генерации проверяют на чистоту микроскопией мазков, окрашенных по Граму, типичность роста, стерильность и засевают 50 см 3 в бутыль, содержащую 10 дм 3 бульона Хоттингера(371,0)С 18-20 часов. Культура второй генерации служит посевным материалом для получения в последующем биомассы. Выращенную и проверенную на чистоту суточную матриксную культуру второй генерации с соблюдением условий стерильности засевают в бутыли со стерильной питательной средой,охлажденной до 37-30 С из расчета 5-10 матриксной расплодки к общему объему питательной среды, одновременно добавляют 0,1(в перерасчете на сухое вещество) стерильного 40-го раствора глюкозы. Культуру, засеянную в бутыли, выращивают 1820 часов при (371,0)С с постоянным перемешиванием и непрерывной аэрации при(371,0)С. В процессе выращивания культуры через 5-6 часов после засева берут пробу для определения , чистоты роста и концентрации микробных тел. Добавляют 40 раствор глюкозы и продолжают выращивать еще в течение 4-6 часов. Выращенную культуру проверяют на чистоту популяции путем микроскопии и высева в пробирки с МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом, агар Сабуро, на чашки Петри с МПА. Культура должна агглютинироваться монорецепторными сыворотками О - //, Х//, Х//, Н - ,//. После получения результатов,подтверждающих отсутствие загрязнения посторонней микрофлорой выращенной культуры(просмотр посевов,микроскопия мазков,окрашенных по Граму), производят определение концентрации микробных клеток по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Бактериальную м массу хранят при температуре от 2 до 4 С 1 - 1,5 суток. Культура сальмонелл должна иметь концентрацию 25 млрд микробных клеток в 1 см 3 и 7,2 - 7,4. Бактериальную суспензию, разведенную средой для лиофилизации (сахарозо-желатиновой средой) до концентрации 25 млрд 1 млрд микробных клеток в 1 см 3 по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича, расфасовывают по 4 см 3 в стерильные ампулы. Погрешность расфасовки 1. После этого ампулы с вакциной подвергают лиофильной сушке и запаивают под вакуумом. ШтаммВ-0284 15 получен из вирулентного штамма,являющегося основным возбудителем сальмонеллеза телят на территории республики, под влиянием стрептомицина. ШтаммВ-0284 15 обладает типичными культуральноморфологическими,биохимическими и антигенными свойствами. Вирулентность вакцинного штамма по сравнению с природным прототипом снижена в 20 раз. Предложенный штаммВ-0284 15 эпизоотически актуален для животноводческих хозяйств Республики Казахстан, изготовленная сухая живая вакцина является эффективной в профилактике сальмонеллеза телят. Вакцина безвредна для телят,обладает высокой иммуногенной активностью, защищает телят от заражения сальмонеллезом. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерииВ-0284,депонирован в ТОО Казахский научноисследовательский ветеринарный институт,используемый для приготовления сухой живой вакцины против сальмонеллеза телят.