Способ получения аллергена из L-форм микобактерий бычьего вида

(51) 61 39/04 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ и активностью при выявлении латентного микробизма,обусловленного персистенцией микобактерий туберкулеза в -форме. Способ получения аллергена из -форм микобактерий бычьего вида,включающий выращивание культуры микобактерий на жидкой питательной среде, автоклавирование и отделение бактериальной массы от культуральной жидкости, в жидкую питательную среду добавляют 1 этония и 2,5 микобактерий бычьего вида, выдерживают при температуре 37 С в течение 6 часов, затем стерилизуют, отмывают центрифугированием в изотоническом растворе при 6000 об/мин в течение 20 мин, осадок дезинтегрируют ультразвуком частотой 22 кГц интенсивностью 20 Вт/см 3 в течение 20 мин и разводят изотоническим раствором до концентрации белка 1 мг/см 3.(73) Товарищество с ограниченной ответствен ностью Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА ИЗ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и иммунологии, в частности при диагностике туберкулеза животных, а именно к способам разработки эффективных методов,предназначенных для аллергической диагностики латентного туберкулеза крупного рогатого скота. Технический результат,обеспечиваемый способом, выражается в получении туберкулина форм микобактерий, обладающего специфичностью Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и иммунологии, в частности при диагностике туберкулеза животных, а именно к способам разработки аллергической диагностики латентного туберкулеза крупного рогатого скота. Способ получения аллергена, включающий выращивание культуры микобактерий на жидкой питательной среде, автоклавирование и отделение бактериальной массы от культуральной жидкости. Патент Российской Федерации 2113 кл. А 61 39/04, А 61 39/35, 1992. Однако эффективность предлагаемого способа при выявлении больных туберкулезом животных в неблагополучных хозяйствах достигает не выше 80. Задачей изобретения является разработка способа получения высокоактивного и специфичного аллергена из -форм микобактерий,предназначенного для диагностики скрытопротекающей латентной туберкулезной инфекции. Технический результат,обеспечиваемый способом, выражается в получении аллергена-форм микобактерий,обладающего специфичностью и активностью при выявлении латентного микробизма,обусловленного персистенцией микобактерий в -форме. Способ получения аллергена из -форм микобактерий бычьего вида,включающий выращивание культуры микобактерий на жидкой питательной среде, автоклавирование и отделение бактериальной массы от культуральной жидкости, в жидкую питательную среду добавляют 1 этония и 2,5 бактериальную массу микобактерий бычьего вида, выдерживают при температуре 37 С в течение 6 часов,затем стерилизуют,отмывают центрифугированием в изотоническом растворе при 6000 об/мин в течение 20 мин, осадок дезинтегрируют ультразвуком частотой 22 кГц интенсивностью 20 Вт/см 3 в течение 20 мин и разводят изотоническим раствором до концентрации белка 1 мг/см 3. Для приготовления аллергена используют штамм-формаВ-00615, который хранится в коллекции лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт (КазНИВИ). Штамм характеризуется следующими признаками-формаВ-0061 КазНИВИ Происхождение штамма микобактерий. Штамм-формаВ-00615, получен путем воздействия -трансформирующего агентана среде Дорожковой (ДИР). Идентифицирован по рекомендации по диагностике латентного микробизма при туберкулезе крупного рогатого скота/ Рекомендации. - Утверждены НТС животноводства и ветеринарии МСХ РК 29.07.2007, протокол 5. Алматы, 2007. - с.8. Сравнен с типовым штаммом коллекционный Идентифицирован по определению микобактерий, , 2009. -.,-1314-1328 . Назначение штамма бактерий. Штамм производственный для приготовления диагностических препаратов. Состав среды и условия культивирования. Растет на полужидкой питательной среде обогащенной сывороткой крови крупного рогатого скота и 20-й сахарозой, ( 7,2) при Т 37-38 С в течение трех недель. Морфолого-культуральные свойства. Цвет бесцветный размеры от 50-100 мкм очертания концов округлые окраска по Романовскому-Гимзе условия роста среда ДИР Т 37-38 С, 21-22 суток в термостате. Физиолого-биохимические свойства. Принадлежность к трофической группе фотоавтотрофы. Типы катабализма аэроб. Симбиотрофные отношения паразитизм. Источники углерода сахароза. Источники азота -аспарагин,лимоннокислый натрий. Источники серы сернокислый магний. Другие характерные физиологические особенности обмена Дифференцирующие и диагностические ферменты каталаза, дегидрогеназа,не разжижает желатин, редуцирует нитраты, не образует кристаллы. Маркерные признаки штамма. Растет на полужидкой питательной среде обогащенной сывороткой крови крупного рогатого скота и 20-й сахарозой, обладает каталазной и дегидрогеназной активностью. Способ, условия и состав сред для хранения. Основные биологические свойства штамма стабильно сохраняются при многократных пассажах. Предлагаемый способ осуществляются следующим образом. Пример 1. Микробактерии бычьего вид - штамм 8 ВИЭВ выращивают в течение 4-5 недель на среде Сотона, отделяют бактериальную массу от культуральной жидкости. Жидкую питательную среду для выращивания -форм микобактерий бычьего вида стерилизуют автоклавированием при 110 С в течение 30 минут, после охлаждения к раствору постепенно добавляют этоний в концентрации 1 и встряхивают до полного растворения препарата. В приготовленную среду помещают бактериальную массу микобактерий бычьего вида в концентрации 2,5 (2,5 г отжатой культуры на 100 см 3 среды). Емкость с полученным содержимым встряхивают, и помещают в термостат при температуре 37 С на 4-6 часов, затем стерилизуют автоклавированием при 120 С в течение 45 минут, после чего полученные -формы отмывают изотоническим раствором путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 20 мин, отжимают фильтровальной бумагой и взвешивают. Готовят взвесь микобактерий из расчета 50 мг бактериальной массы в 1 см 3 изотонического раствора,дезинтегрируют ультразвуком частотой 22 кГц и интенсивностью 20 Вт/см 3 в течение 20 мин, затем вновь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин,разводят изотоническим раствором до концентрации белка 1 мг в 1 см 3 целевого продукта. Пример 2. Полученный аллерген проверяют на активность и реактогенность в опыте на морских свинках. Первоначально определяют активность аллергена,приготовленного из-форм микобактерий бычьего вида в туберкулиновых единицах (ТЕ). Для этого морских свинок заражают взвесью, содержащей 1 млрд микробных клеток в 1 см 3. Через 30 дней после заражения шерсть с обоих боков морских свинок удаляют выщипыванием. Через сутки в депилированные участки кожа вводят внутрикожно по 1,0 см 3 испытуемого аллергена и стандартного ППДтуберкулина для млекопитающих, разведенных по схеме, представленной в таблице 1. Из таблицы 1 видно, всего каждой свинке вводят по 4 инъекции различных разведений стандартной серии аллергена с одной стороны тела и такие же разведения испытываемой серий с другой стороны. Через 24 и 48 часов после введения аллергенов проводят учет реакции путем измерения размера папулы. Положительной реакцией считают проявление гиперемии кожи в месте введения аллергена и образование уплотненной припухлости размером 5 и более мм в диаметре. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 2. Из таблицы 2 следуют, что аллерген,приготовленный из -форм микобактерий бычьего вида, проявляет наибольшую активность при 25 ТЕ в 1 см 3 раствора. Количество ТЕ выводили по туберкулиновому индексу. Одна ТЕ полученного препарата составляет 0,0002 мг сухого вещества. Активность туберкулина в 1 см 3 испытуемой серии вычисляют по формуле А - сумма интенсивности реакций у морских свинок на ППД-туберкулин для млекопитающих Б - сумма интенсивности реакций у морских свинок на предлагаемый аллерген 50 000 - содержание ТЕ в 1 мг ППД-туберкулина. Активность туберкулина предлагаемой серии в 1 мг составила Затем определяют реактогенность аллергена из-форм микобактерий бычьего вида (шт.8). В качестве контроля используют ППД-туберкулин для млекопитающих. Реактогенность аллергена проверяют на здоровых морских свинках. Морским свинкам с одной стороны тела внутрикожно вводят предлагаемый аллерген в дозе 0,01 мг в 1 см 3 стерильного физиологического раствора, с другой стороны - ППД-туберкулин для млекопитающих в той же дозе. Через 24 часа на месте введения препарата не отмечено воспалительной реакции. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии реактогенности. Стерильность аллергена изучают путем посева его на среды МПА, МПБ, Сабуро. На каждую среду(по пять пробирок) высевают по 0,25 см 3 препарата,растворенного в физиологическом растворе до концентрации 1 мг/см 3. Посевы выдерживают в термостате при 37 С для МПА, МПБ и при 20-22 С для среды Сабуро. Через 10 дней в пробирках роста не обнаруживается, что свидетельствует о стерильности препарата. Безвредность аллергена изучают на здоровых белых мышах (10 особей). Пяти мышам подкожно вводят по 0,25 см 3 аллергена, растворенного в физиологическом растворе из расчета 1 мг в 1 см 3,пять белых мышей - контрольные (препараты не вводят). В течение 10 дней все мыши, которым вводился аллерген, остаются здоровыми. На месте введения аллергена у этих животных изменений не обнаружено, что свидетельствует о безвредности препарата. Отсутствие сенсибилизирующих свойств аллергена проверяют на здоровых морских свинках(по шесть голов) для каждой серии. Трем морским свинкам вводят трехкратно по 500 ТЕ препарата в объеме 0,1 см 3 растворителя с интервалом 5 сут, три свинки контрольные. Через 15 суток всем морским свинкам вводят внутрикожно по 500 ТЕ препарата в объеме 0,1 см 3 растворителя. Через 24 часа проводят учет реакции. У всех животных на месте введения наблюдают покраснения размером не более 5 мм. Эти данные указывают на отсутствие сенсибилизирующих свойств предлагаемого аллергена. В результате установлено, что полученный препарат стерилен, безвреден и не обладает реактогенными и сенсибилизирующими свойствами. Таблица 1 Схема составления разведений стандартной и предлагаемой серии туберкулинов Номера разведений 1 2 3 4 Наименование туберкулинов Стандартная серия Содержание сухого вещества в прививной дозе 0,00002 0,0001 0,0005 Содержание сухого вещества в прививной дозе 0,0002 0,0005 0,0025 Таблица 2 Активность аллергена из -форм микобактерий бычьего вида (мм) в опыте на морских свинках в сравнении с ППД- туберкулином для млекопитающих ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения аллергена из -форм микобактерий бычьего вида,включающий выращивание культуры микобактерий на жидкой питательной среде, автоклавирование и отделение бактериальной массы от культуральной жидкости,отличающийся тем, что в жидкую питательную среду добавляют 1 этония и 2,5 микобактерий бычьего вида, выдерживают при температуре 37 С в течение 6 часов, затем стерилизуют, отмывают центрифугированием в изотоническом растворе при 6000 об/мин в течение 20 мин, осадок дезинтегрируют ультразвуком частотой 22 кГц интенсивностью 20 Вт/см 3 в течение 20 мин и разводят изотоническим раствором до концентрации белка 1 мг/см 3.