Способ получения аллергена из атипичных Mycobacterium scrofulaceum

(51) 61 39/04 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ культуры микобактерий Раниона - 2 группы,автоклавирование при 120 С,отделение бактериальной массы от культуральной жидкости фильтрованием,отмывание осадка центрифугированием, в качестве микобактерий Раниона - 2 группы используют штамм-0110, который выращивают при температуре 40 С,автоклавирование осуществляют в течение 40 минут, отделенную бактериальную массу разводят стерильной дистиллированной водой в соотношении 13 соответственно, автоклавируют при 120 С в течение 30 минут, затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 минут, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость смешивают с культуральной жидкостью, которую предварительно упаривают до уменьшения ее первоначального объема в 5 раз, при этом рН смеси доводят до 5,0,добавляют к полученный смеси охлажденный до 4 С этанол в соотношении 14 соответственно, после чего смесь выдерживают в течение 18 часов при 4 С при постоянном перемешивании,затем центрифугируют в течение 20 минут при 6000 об/мин, надосадочную жидкость удаляют полученный осадок отмывают центрифугированием 3000 об/мин в течение 15 минут с помощью стерильного физиологического раствора и разводят стерильным физиологическим раствором до содержания белка, равного 1,0 г в 1,0 см 3 и используют в качестве целевого продукта.(72) Тамгабаева Салиха Сырым Назым Сырымызы Тургенбаев Кайрат Алтынбекович Базарбаев Марат Садикова Данагуль Рахымжановна(73) Товарищество с ограниченной ответствен ностью Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА ИЗ АТИПИЧНЫХ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и иммунологии, в частности при диагностике туберкулеза животных, а именно к способам разработки эффективных методов,предназначенных для дифференциальной диагностики туберкулеза у млекопитающих. Технический результат,обеспечиваемый способом, выражается в получении очищенных аллергенов из культуральной жидкости атипичных микобактерий выделенных от патологического материала из Карагандинской области,обладающего специфичностью и активностью при выявлений организма атипичными микобактериями по классификации Раниона - 2 группы. Способ получения аллергена из атипичных,включающий выращивание на жидкой питательной среде Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и иммунологии, в частности при диагностике туберкулеза животных, а именно к способам разработки эффективных методов,предназначенных для дифференциальной диагностики туберкулеза у млекопитающих. Известен способ получения аллергена из атипичных, включающий выращивание на жидкой питательной среде культуры микобактерий Раниона -3 группы,автоклавирование при 120 С,отделение бактериальной массы от культуральной жидкости фильтрованием,отмывание осадка центрифугированием Предварительный патент РК 14782, (кл. А 61 39/04, С 12 1/20 // 1325), 2004. Однако известный аллерген проявляет перекрестные гетерологические реакции у животных, инфицированных микобактериями по классификации Раниона - 2 группы. Задачей изобретения является разработка способа получения высокоактивных и специфичных аллергенов из атипичных микобактерий,предназначенных для дифференциальной диагностики неспецифических реакций и выявления сенсибилизации организма у млекопитающих атипичными микобактериями. Технический результат,обеспечиваемый способом, выражается в получении очищенных аллергенов из культуральной жидкости атипичных микобактерий выделенных от патологического материала из Карагандинской области,обладающего специфичностью и активностью при выявлений организма атипичными микобактериями по классификации Раниона - 2 группы. Способ получения аллергена из атипичных,включающий выращивание на жидкой питательной среде культуры микобактерий Раниона - 2 группы,автоклавирование при 120 С,отделение бактериальной массы от культуральной жидкости фильтрованием,отмывание осадка центрифугированием, в качестве микобактерий Раниона - 2 группы используют штаммВ-0110, который выращивают при температуре 40 С,автоклавирование осуществляют в течение 40 минут, отделенную бактериальную массу разводят стерильной дистиллированной водой в соотношении 13 соответственно, автоклавируют при 120 С в течение 30 минут, затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 минут, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость смешивают с культуральной жидкостью,которую предварительно упаривают до уменьшения ее первоначального объема в 5 раз, при этомсмеси доводят до 5,0, добавляют к полученной смеси охлажденный до 4 С этанол в соотношении 14 соответственно, после чего смесь выдерживают в течение 18 часов при 4 С при постоянном перемешивании, затем центрифугируют в течение 20 минут при 6000 об/мин, надосадочную жидкость удаляют,полученный осадок отмывают центрифугированием 3000 об/мин в течение 15 2 минут с помощью стерильного физиологического раствора и разводят стерильным физиологическим раствором до содержания белка, равного 1,0 г в 1,0 см 3 и используют в качестве целевого продукта. Для приготовления аллергена используют штаммВ-011038, который хранится в коллекции Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно- исследовательский ветеринарный институт(КазНИВИ). ШтаммВ-011038 Штамм характеризуется следующими признаками. Происхождение штамма микобактерий. Штамм микобактерий выделен от павшего крупного рогатого скота из Карагандинской области, способ выделения - Гельберга, Левенштейна-Йенсена,Павловского, Сотона и отбора колоний в -форме по Аликаевой. Идентифицирован по определению микобактерий 2009. -. ,-1314- 1328 . Сравнен с типовым штаммом коллекционный(эталонный). Назначение штамма бактерий. Штамм производственный для приготовления диагностических препаратов. Состав среды и условия культивирования. Яичная масса, молоко, картофельный отвар,малахитовый зелень, двухосновной фосфорнокислый калий, лимоннокислый натрий, сернокислый магний, пептон, глицерин. Т 37-38 С. Морфолого-культуральные свойства. Скотохромогенные культуры более полиморфны, при выращивании в темноте имеют оранжево-желтый цвет, растут при 37 С в течение 7-14 суток в термостате, на твердых питательных средах образуют гладкие,блестящие,округленные колонии. Физиолого-биохимические свойства. Принадлежность к трофической группе хемоорганотроф. Типы катабализма аэроб. Симбиотрофные отношения паразитизм. Источники углерода глицерин. Источники азота -аспарагин,аммоний сернокислый. Источники серы сернокислый магний. Другие характерные физиологические особенности обмена Дифференцирующие и диагностические ферменты каталаза, уреаза, не разжижает желатин, не редуцирует нитраты, не образует кристаллы. Маркерные признаки штамма. Растет на средах с тубазидом, обладает хемотрофностью, каталазной активностью. Способ, условия и состав сред для хранения. Основные биологические свойства штамма стабильно сохраняются при многократных пассажах. Предлагаемый способ осуществляются следующим образом. Пример 1. Основой для приготовления аллергена служит штаммВ-011038. Бактериальную массу для получения аллергена выращивают в течение 8 недель на среде Сотона, стерилизуют автоклавированием при 120 С в течение 30 мин, отделяют бактериальную массу от культуральной жидкости, культуральную жидкость концентрируют на испарительном роторе до уменьшения ее первоначального объема в 5 раз,бактериальную массу разводят стерильной дистиллированной водой в соотношении 13,автоклавируют при 120 С в течение 30 мин,центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин,полученную надосадочную жидкость смешивают с культуральной жидкостью. Предварительно определяют изоэлектрическую точку специфического белка. С этой целью в два ряда пробирок (по 6 пробирок в каждом ряду) разливают по ровному количеству надосадка с культуральной жидкостью. Используя 2-ный раствор соляной кислоты и 7,5-ный раствор бикорбоната натрия, готовят жидкость в отдельных пробирках со следующими значениями 2, 3, 4, 5,6 и 7. В первый ряд пробирок полученного надосадка с культуральной жидкостью с разными значениямидобавляют по 1 объему охлажденного до 4 С этанола, во второй ряд - по 2 объема этанола и выдерживают в холодильнике при 4 С на 18 часов при постоянном перемешивании. Полученный при этом рыхлый осадок собирают центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин, разводят физиологическим раствором и определяют концентрацию белка по Лоури, после чего конечный продукт используют в качестве аллергена. Пример 2. Полученный аллерген стандартизируют по содержанию белка (1-1,1 мг/мл),затем используют в качестве аллергена. Предлагаемый аллерген проверяют на чувствительность и специфичность,в предварительных опытах на морских свинках. В качестве контроля использовали ППД-туберкулины для млекопитающих и птиц. Биологическую активность аллергена определяют методом серийных разведений на морских свинках, предварительно зараженных культурой атипичных микобактерий по классификации Раниона - 2 группы. Препарат вводят внутрикожно в количестве 0,0005 мг, 0,0001 мг, 0,00002 мг в 0,1 см 3 физиологического раствора,сравнивая их с ППД-туберкулином для птиц в разведении 25, 5 и 1 . Результаты учитывали через 24 и 48 часов путем измерения образовавшихся папул, которые представлены в таблице 1. Количествов 1 мг испытуемого аллергена определяли по формуле Б 2500, где А А - сумма интенсивности реакций у морских свинок на ППД-туберкулин птиц Б - сумма интенсивности реакций у морских свинок на испытуемый аллерген. Активность аллергена испытуемой серии в 1 мг составила 114,5 К 250023100 МЕ 116,5 Результаты интенсивности реакций у морских свинок на введение туберкулезных аллергенов в таблице 1. Из таблицы 1 видно, что опытный аллерген обладает высокой активностью и сопоставим с коммерческим препаратам (10). Результаты специфичности и активности аллергена на морских свинок,сенсибилизированных,разными видами микобактерий представлены в таблице 2. В таблице 2 представлены результаты испытаний на 4 группах морских свинок, зараженных различными видами микобактерий. Данные в таблице 2 свидетельствуют о высокой специфичности испытуемого аллергена, так как на него реагируют только морские свинки 1 группы,сенсибилизированные. Способ получения аллергена из атипичныхВ-0110 38 для дифференциальной диагностики неспецифических реакций крупного рогатого скота обеспечивает (по сравнению с известным способом) получение высокоактивного специфичного аллергена, что позволяет повысить достоверность аллергических реакций. К Таблица 1 Интенсивность реакций у морских свинок на введение туберкулезных аллергенов (в мм) через 24 ч Инв.морск. свинок Интенсивность реакции на введение разведений туберкулинаСтандартный раствор ППД-туберкулин Испытуемый аллерген МЕ для птиц 125 50 25 1 Сумма А 70 14 2,8 0,56 Сумма Б 1 4 6 8 10,5 28,5 7,5 6,5 5,5 5 24,5 2 6,5 6,5 6 4,5 23,5 5 10 8,5 4,75 28,2 3 6 6 5,5 3 20,5 3,5 4,5 4 3 15,0 4 4 5 5,5 6 20,5 6 8 8,5 7 29,5 5 5 6,5 5,5 6,5 23,5 5 4,5 5 4 18,5 всего 25,5 30 30,5 30,5 116,5 27 33,5 33,5 23,75 114,5 А - сумма средних диаметров папул на введение Б - сумма средних диаметров папул на стандартной серии туберкулина введение испытуемой серии туберкулина 3 Таблица 2 Изучение специфичности и активности аллергена на морских свинок, сенсибилизированных разными видами микобактерий Номера морских свинок Наименования аллергенов ППД-туберкулин Испытуемый аллерген для птиц 24 час 48 час 24 час 48 час 12 10 13 10 13 11,5 10,5 9 14 12 12,5 9 13,11,26 11,10,05 120,29 9,30,2 5 7 5 5 5 5,60,76 5 5 5 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения аллергена из атипичных,включающий выращивание на жидкой питательной среде культуры микобактерий Раниона - 2 группы,автоклавирование при 120 С,отделение бактериальной массы от культуральной жидкости фильтрованием,отмывание осадка центрифугированием, отличающийся тем, что в качестве микобактерий Раниона - 2 группы используют штаммВ 0110, который выращивают при температуре 40 С,автоклавирование осуществляют в течение 40 минут, отделенную бактериальную массу разводят стерильной дистиллированной водой в соотношении 13 соответственно, автоклавируют при 120 С в течение 30 минут, затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 минут, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость смешивают с культуральной жидкостью, которую предварительно упаривают до уменьшения ее первоначального объема в 5 раз, при этом рН смеси доводят до 5,0,добавляют к полученной смеси охлажденный до 4 С этанол в соотношении 14 соответственно, после чего смесь выдерживают в течение 18 часов при 4 С при постоянном перемешивании,затем центрифугируют в течение 20 минут при 6000 об/мин, надосадочную жидкость удаляют,полученный осадок отмывают центрифугированием 3000 об/мин в течение 15 минут с помощью стерильного физиологического раствора и разводят стерильным физиологическим раствором до содержания белка, равного 1,0 г в 1,0 см 3 и используют в качестве целевого продукта.