Штамм бактерий Mycobacterium bovis b-0146, используемый для приготовления аллергена при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота

(51) 12 1/20 (2012.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ 0146, используемый для приготовления аллергена для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в изыскании специфичного и чувствительного штамма,используемого при аллергической диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. Штамм бактерийВ - 0146,используемый для приготовления аллергена при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота,депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно исследовательский ветеринарный институт(72) Жумаш Аманжол Слмгерейлы Кадыров Серикбай Оразбаевич(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт-0146,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к области ветеринарии,в частности к ветеринарной микробиологии, и представляет собой штаммВ 26386 Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к ветеринарной микробиологии, и представляет собой штамм микобактерий,используемый для приготовления туберкулина при аллергической диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. Известен штамм бактерий 8(ВИЭВ), используемый для изготовления туберкулина Предварительный патент Республики Казахстан 2980, кл.01 33/53, 1996. Недостатком известного штамма является недостаточная специфичность,вызывающая гетерологичные реакции на атипичные микобактерии 3 группы по классификации Раньона. Задачей изобретения является разработка высокоспецифичного штамма микобактерий для изготовления аллергена при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота, позволяющего выявлять зараженных туберкулезом животных и дифференцировать их от сенсибилизированных атипичными микобактериями,проявляющих неспецифические реакции. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в изыскании специфичного и чувствительного штамма,используемого при аллергической диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. ШтаммВ - 0328 (К-6424),используемый для приготовления аллергена при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота,депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(КазНИВИ). Идентификацию штамма бактерий проводят по основным культурально морфологическим,биохимическим и антигенным свойствам, согласно определителю/, 2009. . ,- 1314-1328 . Сравнен с типовым штаммом- 8 -0045 (ВГНКИ),выделенный от больной туберкулезом коровы в 1934 г,Курская биофабрики, РФ. ШтаммВ - 0146 Происхождение штамма микобактерий. ШтаммВ - 0146 (К-6424) выделен из легкого коровы, убитой с диагностической целью, принадлежавшей ТОО Магаджановский Хромтауского района Актюбинской области. Селекция штамма. Штамм выделен из легкого коровы. Патологический материал отбирали в условиях санитарной бойни. Легкое разрезали на кусочки 0,5 см 3, помещали в ступки, заливали растворами этония и катамина в 1 концентрации для подавления роста контаминирующей микрофлоры,оставляли на 20-30 мин. Затем растворы сливали, кусочки легко тщательно растирали в ступке с незначительным объемом кварцевого песка и физиологического раствора. Полученную суспензию засевали на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена, Гельберга 2 и МПА. Посевыкультивировали в термостате при 38-39 С 20 -90 суток. Посевы просматривали каждые 7 суток. Интенсивность роста микобактерий определяли путем подсчета выросших колоний - до 20 колоний- от 20 до 100 колоний- более 100 колоний. Отбирали колонии в -форме по методу Аликаевой. Высеваемость штаммаВ - 0146 составила 100, интенсивность роста 1,9, что превышало показатели контрольного эталонного штамма. Скорость ростаВ - 0146 в опытных пробирках опережала скорость роста культур контрольного штамма на 10-12 суток. Интенсивность роста тестируемого штамма оценивалась на 3 креста, эталонного - на 1. На среде Евгелевского отмечался рост микобактерий в виде толстой складчатой пленки с широким пристеночным кольцом через 20 суток. На среде Гельберга и Левенштейна - Йенсена образовывались сероватожелтые колонии, гладкие, крошковатые в -форме. На среде Гельберга отмечался рост колоний сероватожелтого цвета. При посеве колоний на среду Гельберга при 20 сутках инкубации и дальнейшем пересеве в одинаковой дозировке на среде Евгелевского отмечалось неодинаковое накопление бакмассы. Значительная временная разница в интенсивности роста культур микобактерий указывала на неоднородность популяции,штаммВ - 0146 по своей репродуктивной активности превосходил эталонный штамм-8 В - 0045. При посеве отдельных колоний микобактерий, выделенных со среды Гельберга, отмечалось, что при пересеве их на среду Левенштейна - Йенсена при 20 сутках инкубации и дальнейшем пересеве в одинаковой дозировке 1,0 мг на 10,0 см 3 среды отмечалось неодинаковое накопление бакмассы. По репродуктивной активностиВ 0146 превосходил эталонный штамм-8 В - 0045 в четыре раза. Исходя из результатов исследований, в целях получения однородного популяционного свойства микобактерий, обладающих сравнительно короткой лагфазой и наибольшей интенсивностью роста,сопровождающейся накоплением более высокой бактериальной массой, были проведены исследования по селекции отдельных колоний микобактерий с активными ростовыми свойствами. В результате проведенного клонирования был выделен изолят К 6424 из популяции штамма,который был выбран для дальнейшей работы, так как за 20 суток культивирования в термостате на среде Евгелевского накопление бактериальной массы составляло более 3 миллиардов микробных клеток в 1,0 см 3 МПБ. У остальных клонов этот показатель был несколько ниже (около 1 млрд м. к. /см 3). При повторной проверке выбранного штамма(изолят К-6424) через 3 месяца после хранения на среде Гельберга под резиновыми парафинированными пробками была установлена стабильность клона в быстроте и интенсивности роста на средах, что указывало на целесообразность его использования при проведении дальнейших исследований по отбору штамма для изготовления диагностического препарата. Изолят К-6424 был условно обозначен штаммом, В-0146 К-6424,который депонирован в коллекции микроорганизмов ТОО Научно-исследовательский ветеринарный институт. Назначение штамма. Штамм производственный для приготовления диагностических препаратов. Состав среды культивирования яичная масса,молоко, картофельный отвар, малахитовая зелень,двухосновной фосфорно-кислый калий,лимоннокислый натрий, сернокислый магний, пептон,глицерин, Т 38-39 С. Морфологические признаки.В-0146 (К-6424) -прямые короткие палочки с обрубленными концами. Возможно образование нитей или подобия мицелия, однако эти структуры легко распадаются на палочки или кокки. Внутри клеток иногда располагаются зерна(Муха). Зерна располагаются на полюсах бактериальной клетки. Микобактерии - тонкие палочковидные клетки с характерным свойством кислото и спиртоустойчивости. Свойство кислотоустойчивости обусловлено присутствием восков в клеточной стенке. По Граму окрашиваются с трудом, слабо грамположительные. Хорошо заметных воздушных гиф не образуют. Микобактерии неподвижные,окрашиваются анилиновыми красками. Хорошо окрашиваются по методу Циль-Нильсена. Спор, капсул, конидий не образуют. В тканях животных микобактерии более удлиненные. Располагаются изолированно или образуют небольшие группы. Культуральные свойства. Микобактерии - строгие аэробы. Хорошо развиваются на глицериновых питательных средах, оптимальная температура роста 38-39 С, присреды 6,8 - 7,4. Колонии желтоватого цвета, пигмент недиффундирующий поверхность колоний обычно матовая или шероховатая. Рост культур микобактерий на жидких питательных средах с глицерином появляется через 1-30 дней после посева,иногда позже в виде пленки. На плотных средах вначале образуются слегка заметные микроколонии,которые затем увеличиваются и приобретают различные размеры. На поверхности среды видны мелкие либо крупные, блестящие или матовые,гладкие или шероховатые сухие единичные колонии,либо сплошной рост, когда колонии сливаются, они образуют налет беловато-желтого цвета. На плотных яичных средах микобактерии бычьего вида растут в виде мелких шаровидных, цвета слоновой кости колоний. Встречаются морщинистые колонии. На жидких средах растут в виде отдельных островков,постепенно сливающихся в пленку, на полужидких средах дают рост в глубине среды, которая со временем мутнеет. Культивируются на средах. Гельберга, Левенштейна - Йенсена, Евгелевского,Сотона, Павловского. Учет характера роста необходимо проводить через 20-90 суток. Биохимические свойства. Принадлежность к трофической группе хемогетеротрофы. Облигатные аэробы. Симбиотрофные отношения паразитизм. Источники углерода глицерин. Источники азотааспарагин, аммоний сернокислый. Источник серы сернокислый магний. Обладают каталазной и дигидрогеназной активностью. Другие характерные физиологические особенности обмена дифференцирующие и диагностические ферменты каталаза, уреза, не разжижают желатин, редуцируют нитраты в нитриты, не образуют кристаллы. Не образуют сероводород и индол, не разжижают желатин. Положительные ниациновый тест, проба с салицилатом натрия. Арилсульфатоположительные,устойчивы к лизоциму. Маркерные признаки штамма. Растут на средах с тубазидом, обладает хемотрофностью, каталазной,дигидрогеназной и амидазной активностью. Микобактерии входят в МТВС, имеют степень родства(порядка 99,9) и идентичны по последовательности 16 рРНК. Антигенная структура. Антигены микобактерий малоактивны. Протективные свойства антигена микобактерий связаны соединением миколовой кислоты. Дифференцирующим компонентом клеточной стенки является пептидоглюкан (муреин). Физиологические свойства. Хемоорганотроф,обладают дыхательным и бродильным метаболизмом. Обладают глицеринофильностью. Для размножения микобактерий необходимы фосфор, калий, магний,сера, железо. Облигатный аэроб. Фаголизабилен,гидрофобен. Серологические свойства. Титры в РСК 140,180. Патогенные свойства. ШтаммВ-0146 (К-6424) патогенен для крупного рогатого скота и лабораторных животных (кроликов, морских свинок). 1,0 мг сырой бактериальной массы,суспендированной в 1,0 см 3 стерильного физиологического раствора, вызывает у морских свинок и кроликов развитие генерализованной формы туберкулезного процесса. Широко распространен в почве и воде облигатный паразит, патогенен для позвоночных. Пример 1. Основой для приготовления аллергена является штаммВ-0146 (К-6424). Питательной средой для изготовления культивирования штамма является жидкая среда Сотона. Среда Сотона для приготовления питательной среды необходимы двухосновной фосфорно-кислый калий 0,5 г сернокислый магний -0,6 г лимонноаммиачное железо-0,05 г лимонная кислота 2 г аспарагин -4,0 г глицерин 60,0 смдистиллированная вода 940,0 см . Соли растворяют в указанной последовательности до полного растворения предыдущего ингредиента. Допускается подогревать раствор для улучшения растворения. Раствор подщелачивают нескольким каплями 30 едкого натра или аммиака до 7,2, разливают по колбам и стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 15 мин. Микобактерии бычьего вида штамм (штамм В-0146) выращивают в течение 8 недель на жидкой среде Сотона, стерилизуют автоклавированием при 120 С 30 мин,отделяют бактериальную массу от культуральной жидкости, культуральную жидкость концентрируют в испарительном роторе до уменьшения ее первоначального объема в 5 раз и 3 центрифугируют при 3 тыс об/мин 15 мин, смешивают Безвредность аллергена изучают в опыте 10 на надосадочную и культуральные жидкости, доводятбелых мышах массой 16-18 г. Пяти белым мышам до 4-5 с последующим приливанием охлажденного подкожно вводят по 0,25 см аллергена, растворенного этанола в соотношении 12, 14, выдерживают 18 часов в стерильном физиологическом растворе из расчета при температуре 4 С при постоянном помешивании, 1,0 мг на 1,0 см 3, 5 белых мышей контрольные. В центрифугируют 20 мин при 6 тыс об/мин, отмывают течение 10 дней (срок наблюдения) опытные мыши полученный осадок физраствором до концентрации остаются здоровыми. На месте введения туберкулина белка 1,0 мг/1 см 3. Предлагаемый способ, в сравнении у опытных животных изменений не обнаружено, что с аналогом, позволяет получить аллерген более свидетельствует о безвредности препарата. Отсутствие сенсибилизирующих свойств препарата высокой специфичности. Приготовление посевного материала. Культуру проверяют в опыте на здоровых морских свинках (поВ-0146 (К-6424) первой шесть голов) для каждой серии. Трем морским генерации проверяют на чистоту микроскопией свинкам вводят по трехкратно по 500 туберкулиновых мазков, окрашенных по Циль-Нильсену, типичность единиц (ТЕ) препарата в объеме 0,1 см 3 растворителя с роста, стерильность. Культура второй генерации интервалом 5 сут., три свинки контрольные. Через 15 служит посевным материалом. Бактериальную массу сут. свинкам опытной и контрольной групп вводят из штаммаВ-0146 (К-6424) для подкожно по 5000 ТЕ туберкулина в 0,1 см получения аллергена выращивают в течение 8 недель растворителя. Через 24 часа проводят читку реакции. на среде Сотона, стерилизуют автоклавированием при У всех животных на месте введения препарата 120 С в течение 30 минут, отделяют бактериальную наблюдают покраснение размером не более 5,0 мм. массу от культуральной жидкости, культуральную Результаты опыта указывают на отсутствие жидкость концентрируют на испарительном роторе до сенсибилизирующих свойств у предлагаемого уменьшения е первоначального объема в 5 раз, препарата. Специфичность аллергена проверяют в опыте на 50 бактериальную массу разводят стерильной дистиллированной водой в соотношении 13, морских свинках и 50 головах крупного рогатого автоклавируют при 120 С в течение 30 мин, скота. Морским свинкам с одной стороны тела в водят центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин, аллерген в дозе 0,01 мг в 0,1 см 3 стерильного полученную надосадочную жидкость смешивают с физиологического раствора, с другой стороны ППД туберкулин для млекопитающих в той же дозе. Через культуральной жидкостью. 24 часа после введения препарата не отмечено Пример 2. Для изготовления аллергена предварительно воспалительной реакции. Крупному рогатому скоту определяют изоэлектрическую точку специфического вводят внутрикожно верхнюю треть шеи в дозе 0,2 мг белка. С этой целью в два ряда в 0,2 см 3 стерильного физиологического раствора, с пробирок (по 6 пробирок в каждом ряду) разливают по другой стороны вводят ППД - туберкулин (контроль) ровному количеству надосадка с культуральной для млекопитающих в той же дозе. Через 72 часа на введения аллергенов не отмечают жидкостью. Используя 2 раствор соляной кислоты и месте 7,5 раствор бикарбоната натрия, готовят жидкость в воспалительной реакции. Предложенный штаммВ-0146 отдельных пробирках со следующей 2, 3, 4, 5, 6 и 7. В первый ряд пробирок полученного надосадка с (К-6424) эпизоотически актуален, изготовленный культуральной жидкостью с разными значениямиаллерген является эффективным для диагностики добавляют по 1 объему охлажденного до 4 С этанола, туберкулеза крупного рогатого скота. Полученный из во второй ряд - по 2 объема этанола и выдерживают в штамма аллерген обладает высокой холодильнике при 4 С 18 часов при постоянном чувствительностью и специфичностью,при перемешивании. Полученный при этом рыхлый осадок постановке пробы не отмечается положительных собирают центрифугированием при 6000 об/мин в реакций на атипичные микобактериозы, кроме того, он течение 20 мин, разводят физиологическим раствором позволяет дифференцировать туберкулез крупного и определяют концентрацию белка по Лоури, после рогатого скота от микобактериозов, вызываемых чего конечный продукт используют в качестве атипичными микобактериями. аллергена. Пример 3 Стерильность полученного аллергена ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ проверяют путем посева его на МПБ, МПА, МППБ,Штамм бактерий,среду Сабуро. На каждую среду высевают по 5,0 см 3 препарата, растворенного в физиологическом растворе депонированный в Лаборатории по изучению в концентрации 1,0 мг/ см 3. Посевы на МПБ, МПА, генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научноМППБ выдерживают в термостате при 37 С 24 часа, исследовательский ветеринарный институт под на среде Сабуро при комнатной температуре 10 суток. номером В-0146, используемый для приготовления Если в пробирках роста не обнаружено, то препарат аллергена при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. считают стерильным. Верстка Сарсекеева А.И. Корректор Мадеева П.А.