Штамм микроорганизма Helicobacter pylori GB1 (B-0573), используемый при разработке методов диагностики хеликобактер-ассоциированных заболеваний

(51) 12 1/20 (2011.01) 01 33/53 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Штаммгенотипирован по 16 рРНК, охарактеризован на гены факторов вирулентности такие, как , , , ,А, . Для получения штамма продуцента использовали биопсию слизистой оболочки желудка пациента с патологией желудочно-кишечного тракта, с которой проводили посев на плотную питательную селективную средув микроаэрофильных условиях. Посевы инкубируются при температуре 37 С, влажности 98, в микроаэрофильных условиях в течение 3-10 суток. . растет в атмосфере, содержащей 5 кислорода, 5-10 углекислого газа, остальное составляет азот. Для данного микроорганизма губительны как анаэробные условия, так и более высокое содержание кислорода. Для создания микроаэрофильной атмосферы используют газогенераторные пакеты, которые продуцируют газовые смеси после добавления в них воды. Оптимальный рост колоний наблюдают при рН среды от 6,7 до 8,0. Время инкубации 5 дней. Штамм . 1(-0573) с известными генами вирулентности может служить как контроль для разрабатываемых тест-систем в клинической медицинской диагностике.(72) Кулмамбетова Гульмира Нигметжановна Иманбекова Меруерт Куатбековна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(-0573),ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ПРИ РАЗРАБОТКЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ХЕЛИКОБАКТЕРАССОЦИИРОВАННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине при разработке методов диагностики хеликобактерассоциированных заболеваний. Новый штаммпополняет коллекцию микроорганизмов Национального референтного центра по ветеринарии. Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма бактерии,который может быть использован при разработке методов диагностики хеликобактерассоциированных заболеваний. В настоящее время установлено, что бактерияявляется причиной развития хеликобактерного хронического гастрита,важнейшим фактором патогенеза язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и желудка, лимфомы желудка низкой степени злокачественности (мальтлимфомы), а также рака желудка. Лечение ряда заболеваний гастродуоденальной зоны включает в себя в качестве обязательного компонента проведение эрадикационной терапии в случае обнаружения у больных в слизистой оболочке желудка Н За последние 20 лет было разработано большое количество методов диагностики, позволяющих выявлять и идентифицировать этот микроорганизм. Развитие и усовершенствование этих методов помогло в получении ценной информации об эпидемиологии хеликобактериоза,сыграло большую роль в понимании патогенеза этой инфекции. Это, в свою очередь, позволило разработать наиболее эффективные схемы противохеликобактерной терапии и мероприятия,направленные на профилактику хеликобактериоза. Тем не менее, ни один из существующих методов диагностики . - инфекции не универсален. Пределы возможностей этих методов могут быть ограничены не только их чувствительностью, но,зачастую зависят от возраста пациента, его индивидуальных особенностей, стадии заболевания,а также индивидуальных характеристик инфекции. Штамм . В-0573 с известной генетической характеристикой может служить как контроль для разрабатываемых тест-систем в клинической медицинской диагностике. Известен штамм 99(700824) , 85963 выделенный от пациента с дуоденальной язвой, США (99,..2008-09-01). Недостатком указанного штамма является отсутствие гена . Задачей изобретения является получение нового штамма, с известными генами вирулентности , 1, , , , ,используемого в медицинской диагностике. Технический результат - положительный контрольный образец в молекулярно-биологических тест-системах для медицинской диагностики. Характеристика штамма. Происхождение штамма. Описанный штаммВ-0573 выделен от пациента с хроническим гастритом. спиралевидная грамотрицательная бактерия, около 3 мкм в длину,диаметром около 0,5 мкм. В неблагоприятных условиях, а также в зрелых или старых культурах обладает способностью превращаться из спиралевидной в круглую или шарообразную кокковидную форму. Таксономическая принадлежность. Царство бактерии, тип протеобактерии, класс эпсилон-протеобактерии,порядок, семейство ,род , вид. Культурально-морфологические признаки. При культивировании . возникают определенные трудности,так как эти микроорганизмы микроаэрофилы и растут в особых условиях. Необходимую для культивирования атмосферу создавали заполнением анаэростатов газовой смесью. Таким образом, инкубация чашек с посевами производили в микроаэрофильной атмосфере (5 2, 10 С 2, 85 2)100, в течение 57 дней. Поскольку для данного микроорганизма губительны как анаэробные условия, так и более высокое содержание кислорода. Оптимальный рост колоний наблюдался присреды от 6,7 до 8,0 при 37 С. Состав среды представлен в таблице 1. Таблица 1 Питательная среда, использованная для выделения . Посевы инкубируются при температуре 37 С,влажности 98, в микроаэрофильных условиях в течение 3-10 сут. Н.растет в атмосфере,содержащей 5 кислорода, 5-10 углекислого газа,остальное составляет азот. Для создания микроаэрофильной атмосферы используют газогенераторные пакеты, которые продуцируют газовые смеси после добавления в них воды. Оптимальный рост колоний наблюдают присреды от 6,7 до 8,0. Время инкубации 5 дней. Колонии Н. приобретают характерное золотисто-желтое окрашивание,за счет 2 колумбийский агар - 39 г дистиллированная вода 1000 мл стерильная лошадиная донорская сыворотка- 20 стерильный дрожжевой автолизат-10 колистин- 1 мл/л (7,5 мг/мл) присутствующего в этой среде трифенилтетразолий хлорида. Н.на 3-5 сутки при первичном посеве и на 2 сутки при пересевах чистой культуры формирует мелкие, круглые, гладкие, прозрачные,росинчатые колонии диаметром 1-3 мм. На твердых питательных средах бактериальные клетки образуют гладкие мягкой консистенции матовые, бесцветные,однородной структуры. Н. не ферментирует глюкозу, не продуцирует нитраты, не образует индол. При появлении колоний,сходных по морфологии с Н. (диаметром до 0,5 - 2 мм в виде капель росы или при сплошном росте,образующие прозрачную пленку), происходит их идентификация. Для идентификации мазки окрашивают по Грамму. Под микроскопом в случае Н.обнаруживают грамотрицательные изогнутые палочки. Проводят биохимическое типирование уреазная, каталазная, оксидазная активность. Идентификация штамма была также осуществлена методом определения прямой нуклеотидной последовательности фрагмента 16 гена, с последующим определением нуклеотидной идентичности с последовательностями депонированными в международной базе данных. Амплификация фрагмента 16 гена Реакция ПЦР была выполнена с универсальными праймерами 8 5 - -3 и 806- 5 в общем объеме 20 мкл. ПЦР смесь содержала 150 нг ДНК,1 Ед., 2,52, 10 пмоль каждого праймера. Программа ПЦР амплификации включала длительную денатурацию 95 С в течение 7 минут 30 циклов 95 С - 30 секунд, 55 С- 40, 72 С - 1 минута заключительная элонгация 7 минут при 72 С, ПЦР программа была выполнена с применением амплификатора 9700 ( ). Результаты ПЦР амплификации детектировались электрофоретически в 2 агарозном геле в УФ трансэлюминаторе. Наличие яркой специфической полосы на уровне 800 п.н. свидетельствует о прохождении ПЦР. Определение нуклеотидной последовательности Очистку ПЦР продуктов от не связавшихся праймеров проводили, ферментативным методом используя,и щелочную фосфатазу (, ). Реакцию секвенирование проводили с применением 3.1( ) согласно инструкции производителя,с последующим разделением фрагментов на автоматическом генетическом анализаторе 37301 Нуклеотидные последовательности 16 гена идентифицируемого штамма были анализированы и объединены в общую последовательность в программном обеспечении 2.6.0 ( ). После чего были удалены концевые фрагменты (нуклеотидные последовательности праймеров,фрагменты,имеющие низкий показатель качества) что позволило нам получить нуклеотидную последовательность протяженностью 730 п.н.,которые были идентифицированы впо алгоритму. Нуклеотидные последовательности и результаты идентификации представлены ниже. Размер генома, наличие и характеристика плазмид геном 1643831 пар оснований. НМ 046432.1.64 16,В результате генотипирования (таблица 2) выделенный штамм был идентифицирован как вид Н. . Таблица 2 Результат идентификации штамма методом анализа фрагмента 16 гена использованы,как молекулярно-биологическая характеристика штамма. Контаминация. Контаминантов в клетках включая бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружено. Криоконсервация. Среда для хранения культуры В с добавлением 30 3 деградации и разрушения межклеточного матрикса и базальной мембраны, опухолевой инвазии и метастазировании в раковые клетки в желудке,стимуляции выработки интерлейкина-8,способствует повышению активности антрального гастрита. Ген вакуолизирующего цитотоксинафактор адгезии, увеличивает проницаемость мембран по отношению к анионам, достоверно уменьшает скорость реэпителизации экспериментальных язв и пролиферацию эпителиоцитов за счет нарушения функции клетки,связанных с целостностью ее цитоскелета,пассивный транспорт мочевины через эпителиальные клетки желудка, влияет на выживание Н.в клетках хозяина, снижает содержание АТФ в эпителиоцитах, стимулирует апоптоз клеток. Адгезин , рецептор клеток ,предположительно связан с более высокой частотой развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, осложнений инфекции Н. , а также с аденокарциномой желудка (ВаА 2). Адгезининдуцирует контакт с эпителием. Ген цитотоксичности - , существующий в двух аллельных вариантах(встречается при язвенной болезни) и 2 (обнаруживается при гастрите). Предполагается, что патогенность продуктов, кодируемых этим геном, определяется влиянием их на активность бактериального фермента метилтрансферазы. Таблица 3 Определение факторов вирулентности , , , , аА,в штамме .и 20 глицерина (хранить 4). Среду разлить по 0,5-0,3 мл, аликвотить строго до работы с культурой. Собрать клетки с 1/2 чашки 48-ми часовой культуры Условия размораживания. Достать замороженную пробирку с -70, разморозить,ресуспендировать наконечником на чашку с агаром перенести 100 мкл и полностью втереть шпателем,этим же шпателем провести по новой чашке для получения одиночных колоний. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 85. Для увеличения жизнеспособности крио культуры проводится посев в жидкую среду В с добавлением 10 и 5 дрожжевого автолизата, инкубирование при 37 С, в течение 24-120 часов до 6000,8. Штамм микроорганизма В-0573 используют следующим образом. Пример 1. Способность Н.колонизировать слизистую желудка и вызывать гастрит либо язву желудка зависит от индивидуальных особенностей конкретного штамма бактерии. Были определены шесть факторов вирулентностицитотоксинассоциированный антигенвакуолизирующий токсини факторы адгезии , 2 ПЦР в реальном времени проводили на приборе 5 (, США) с использованием следующих реактивов десятикратный ПЦР-буфер (670 мМ( 8.8), 166 мМ (4)24 Х-100), 25 мМ 2) смесь(250 мкМ), растворы олигонуклеотидов (5 пмоль/ мкл), термостабильная ДНК-полимераза (-, 5 ед/мкл), деионизованная вода (2). Все перечисленные реактивы производились НПФ Литех, Москва. Реакция амплификации проходит в 20 мкл смеси,содержащей 1 мкл ДНК Н. , 2 мкл ПЦРбуфера 10 (Литех, Москва), 2 мкл 10(Литех, Москва), 2 мкл 25 мМ 2 (Литех,Москва), по 1 мкл каждого праймера, 0,5 мкл зонда,0,1 мкл - (Литех, Москва), 11 мкл 2 при следующих температурных режимах 95 С -1 мин 94 С- 15 сек 55 С-20 сек 68 С - 20 сек - 45 циклов. Результаты о наличии генов вирулентности детектируются графически на приборе путм визуального накопления ПЦР продуктов амплификации специфических фрагментов гена ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм микроорганизма 1,депонированный в коллекции депозитарии ГУ Национальный референтный центр по ветеринарии КГИ в АПК МСХ РК, лаборатория Национальная коллекция депонированных штаммов микроорганизмов, под регистрационным номером -0573, используемый при разработке методов диагностики хеликобактерассоциированных заболеваний.