Способ получения инактивированной вакцины против трихофитии верблюдов

(51) 61 39/00 (2006.01) 61 39/116 (2006.01) 12 1/14 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ использовано для активной профилактики и лечения трихофитии верблюдов. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении стабильной,безвредной и высокоэффективной инактивированной вакцины против трихофитии верблюдов. Способ получения инактивированной вакцины против трихофитии верблюдов, включающий накопление биомассы культур трихофитийных спор и е инактивирование, в качестве антигена используют штамм-0174 КазНИВИ 14, который дезинтегрируют в УЗДН-1 при частоте 22 кГц и мощности 100 Вт/см 2 ультразвуковых волн до полного разрушения споровых элементов гриба, затем доводят концентрацию белка до 1,5 мг/см 3 и получают целевой продукт.(72) Умитжанов Мынбай Токеев Шукирбай Орынбаевич Бижанов Болат Рахметович Боранбаева Райхан Султанмуратовна Шалабаев Болат Абуович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ТРИХОФИТИИ ВЕРБЛЮДОВ(57) Изобретение относится к области микологии, а именно к способу получения противомикологической вакцины и может быть Изобретение относится к области микологии, а именно к способу получения противо микологической вакцины и может быть использовано для активной профилактики и лечения трихофитии верблюдов. Известен способ получения инактивированной вакцины против трихофитии животных,включающий накопление биомассы культуры трихофитийных спор и е инактивирование Патент Российской Федерации 02084241, кл. А 61 39/00,1997. Недостатком способа получения вакцины против трихофитии животных является низкая эффективность. Задачей изобретения является повышение иммуногенности вакцины и расширение диапазона эффективности специфической профилактики и лечения трихофитии верблюдов. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении стабильной,безвредной и высокоэффективной инактивированной вакцины против трихофитии верблюдов. Способ получения инактивированной вакцины против трихофитии верблюдов, включающий накопление биомассы культур трихофитийных спор и е инактивирование, в качестве антигена используют штамм-0174 КазНИВИ 14, который дезинтегрируют в УЗДН-1 при частоте 22 кГц и мощности 100 Вт/см 2 ультразвуковых волн до полного разрушения споровых элементов гриба, затем доводят концентрацию белка до 1,5 мг/см 3 и получают целевой продукт. Изобретение осуществляется следующим образом. Штамм гриба, используемый для получения инактивированной вакцины против трихофитии верблюдов депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО КазНИВИ и обладает следующими свойствами. Штамм гриба-0174 КазНИВИ 14. Культуральные свойства. Культуры гриба медленно растущие, рост колоний заметен в течение 24 ч после посева, на 4-5-й день начиналось образование типичных канделябров и рогов северного оленя, через 7 дней гриб разрастается по всему объему среды. Первичные культуры развивается очень медленно, к 30-му дню формируется сероватые, плоские, плотносросшиеся с субстратом и глубокими отпрысками в питательную среду колонии диаметром от 7 до 10 мм. Форма колонии ровная, бархатистая концентрическими кругами. Размер колонии достигает от 25 до 40 мм. Цвет колонии бежевый,возвышенный, бугристый, складчатый. Обратная сторона колонии окрашена в коричневый цвет. Обладает полиморфизмом. В питательную среду выделяет коричневый пигмент. Гифы разной ширины (от 1,6 до 9 мм), которая преобладают широкий неравномерно утолщенной ветвящийся мицелий. Часто можно обнаружит ветвление 2 конечных гиф в виде рогов северного оленя. При созревании культур образуются цепочки артроспор(6-18 мкм), а затем обильные хламидоспоры (617 мкм). Очищенные культуры гриба на питательных средах увеличивают энергию роста и способствуют спорообразованию. Степень развития мицелия приходится на 18-21 день. Размеры макроконидии от 16 до 50 мкм, а микроконидии - значительно варьируют в размерах 2,5-5,03,0-10,0 мкм. Биохимические свойства. Штамм гриба-0174 КазНИВИ 14 не испытывают потребности в витаминах для роста и спорообразования. Никатиновая, фолиевая кислоты,тиамин, придоксин, рибофлавин, цианкобаламин не стимулируют развитие культур данного штамма. Сероводород и индол не образуют. Антигенные свойства. На введения культуры штамма в организме верблюжат, кроликов и морских свинок образуются специфические агглютинины в титрах 140-11280. Маркерные признаки. Биохимические - на сусло агаре при 7,2-7,4 до концентрации 250300 млн/см 3. Макроконидии отсутствуют или единичные, удлиненно-овальные. В очищенных культурах с увеличением микроконидии образуются в небольшом количестве макроконидии (размером от 15 до 53 мкм). Микроконидии отсутствуют или единичные, значительно варьируют в размерах 2,55,03,0-10,0 мкм. Физиологические хемогетеротроф. По отношению к кислороду аэроб. Не обладает метаболическими свойствами. Иммунохимические - в реакциях РДСК и РНГА титры антител составляет от 180 до 11280 отличается от эпизоотических штаммов слабой вирулентностью, высокой спорогенностью и активностью при внутримышечном введении. Патогенные свойства. Штамм гриба-0174 КазНИВИ 14 патогенен для верблюдов, человека и лабораторных животных,обладают цитопатогенным действием на культуры клеток. Иммуногенность. При двукратном внутримышечном введении штамма в дозе 20106 микроконидии создают напряженный иммунитет у привитых верблюжат, кроликов и морских свинок к последующему заражению трихофитией с продолжительностью не менее 12 месяцев. Безвредность. Штамм гриба-0174 КазНИВИ 14 безвреден для верблюжат,кроликов и морских свинок в дозе 20106 микроконидии при внутримышечном введении. Реактогенность. Штамм гриба-0174 КазНИВИ 14 слабореактогенен для верблюдов при внутримышечном введении. У привитых животных спустя 2-3 недели на месте инъекции развивается специфически локализованный поверхностный очажок диаметром 1,0-2,0 см, который самопроизвольно излечивается в течение 2-х недель. Спорообразование. Максимальный уровень спорообразования на сусло-агаре 250-300 млн/см 3. Реверсабельность и реактогенность. Штамм гриба-0174 КазНИВИ 14 отличается от эпизоотических изолятов слабой вирулентностью, отсутствием заражения при контакте между животными, высокой активностью при внутримышечном введении животным. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма гриба-0174 КазНИВИ 14 стабильно сохраняются на протяжении 3-4 лет при условии редких пересевов (2-3 раза в год) не ослабляет патогенные свойства. Сохраняемость в лиофильно-высушенном состоянии в присутствии жидкого обезжиренного молока штамм гриба-0174 КазНИВИ 14 не снижает активности при температуре 2-10 С в течение 12 месяцев в нативном состоянии в течение 6 месяцев, в замороженном при минус 40 С в течение 6 месяцев,при 20 С ниже в течение 2 года. После растворения из лиофилизированного состояния физиологическим раствором хлорида натрия с 7,2-7,4 гриб сохраняет биологическую активность при температуре 28 С в течении 5 час, при 4 С - 3 сут. Пример 1. Для получения инактивированной вакцины против трихофитии верблюдов берут 18 сут культуру штамма-0174 КазНИВИ 14 и выращивают в матровых колбах на суслоагаре при 7,2-7,4 и температуре 28 С в течение 18 дней. Выращенную грибницу культуры в условиях асептики снимают с поверхности питательной среды стеклянными грибными скребками и помещают в стерильные банки. На собранный вакцинный штамм из расчета 11 добавляем по 300,0 см стерильный физиологический раствор. Грибную массу штамма гомогенизируют в миксерах,затем подвергают разрушению ультразвуком на УЗДН-1 частотой волн 22 кГц,интенсивностью 100 Вт/см 2 в течение 1 часа. После разрушения гомогенная масса помещается в холодильник при температуре 4-8 С в течение 1 сут. Затем берется проба для микроскопического анализа на наличие не разрушенных спор с последующим посевом на питательные среды. После этого берутся 3 пробы для бактериологического и микологического контроля в дозе 1,0 см 3. Далее полученную гомогенную массу центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин. Верхний слой гомогената необходимо для изготовления моновакцины. С помощью фотоэлектроколориметром определяют концентрацию полученного белка в 1,0 см 3 полученного супернатанта. После к грибной суспензии антигена на солевом растворедобавляют гель гидрата окиси алюминия (8-12) по сухому веществу. Посуточную смесь ставят в термостат до 1 сутки и время от времени перемешивают 3-5 раз. После этого к вакцине добавляют глицерин (98 химически чистый) из расчета 8-12 от объема гомогената. Все тщательно перемешивают, разливают по 2,0 см 3 в стерильные ампулы объемом 2,0-5,0 см 3 или по 10, 50, 100, 200 и 500 см 3 во флаконы объемом от 10, 50, 100, 200 и 500 см 3, затем запаивают ампулы в стерильных условиях с помощью газовой горелки, а флаконы закрывают резиновыми пробками, завальцовывают алюминиевыми калпочками и этикетируют. Пример 2. Для изучения иммуногенной активности инактивированной вакцины против трихофитии верблюдов берут одну группу животных, в которых находятся пять голов кроликов. Опытной группе вводят внутримышечно по 1,0 см 3 ресуспензированной инактивированной вакцины в область крупа дважды с интервалом 14 дней. Спустя 25-28 дней после второй иммунизации,все 5 голов животных опытной группы, а также по 5 голов из контрольной группы(не иммунизированных животных) экспериментально заражают гомологичной вирулентной эпизоотической культурой рода . В течение 30-35 дней за опытными и контрольными группами животных ведут наблюдение, а клинический осмотр животных осуществляют через каждые 3-5 дней. От животных с клиникой трихофитии отбирают патологический материал, и проводят высевы на питательные среды и уточняют визуально полученный диагноз заболевания данных животных трихофитией. При обнаружении у животных трихофитий, а также подтверждения диагноза, животных подвергают лечению двух или трехкратному введению профилактической дозы жидкой инактивированной вакцины в тех же интервалах, что и профилактические дозы данного биологического препарата. Результаты проведенной работы учитываются спустя 25-30 дней после второй иммунизации заболевших животных терапевтической дозой инактивированной вакциной против трихофитии верблюдов. Результаты иммуногенной активности(профилактической и терапевтической дозы) инактивированной вакцины против трихофитии верблюдов отражены в таблицах 1 и 2. Из таблицы 1 и 2 видно, что инактивированная вакцина против трихофитии верблюдов при ее проверке на иммуногенную активность проявила высокую профилактическую и терапевтическую эффективность, в том числе и при лечении заболевших животных с явной клинической формой трихофитии верблюдов. Использование предлагаемого способа получения инактивированной вакцины против трихофитии верблюдов в ветеринарной практике позволит повысить эффективность мероприятий по профилактике и терапии от возбудителя трихофитии верблюдов в Республике Казахстан. Таблица 1 Профилактическая эффективность инактивированной вакцины против трихофитии верблюдов Результаты опытов (количество заболевших животных при экспериментальном заражении гомологичной вирулентной эпизоотической культурой гриба рода ) Вид животных и их Количество группы возраст голов Заболело животных Не заболело Диагноз не Диагноз подтвердился подтвердился Опытная группа (дважды иммунизированные животные) 1 Кролики 5 5 Контрольная группа (не иммунизированные животные) 1 Кролики 5 5 5 Таблица 2 Проверка терапевтической эффективности инактивированной вакцины против трихофитии верблюдов ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения инактивированной вакцины против трихофитии верблюдов, включающий накопление биомассы культуры трихофитийных спор и е инактивирование, отличающийся тем,что в качестве антигена используют штамм-0174, который дезинтегрируют в УЗДН-1 при частоте 22 кГц и мощности 100 Вт/см 2 ультразвуковых волн до полного разрушения споровых элементов гриба, затем доводят концентрацию белка до 1,5 мг/см 3 и получают целевой продукт. Результаты исследования не выздоровело выздоровело