Способ получения туберкулина из культуры микобактерий птичьего вида

(51) 61 39/04 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ автоклавируют при 120 С в течение 30 мин,отделяют бакмассу от культуральной жидкости фильтрацией через воронку с двойным слоем стерильной фильтровальной бумаги,затем культуральную жидкость упаривают до соотношения 101 на испарителе, полученный концентрат центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин и осаждают из не протеин 30 трихлоруксусной кислотой из расчета 0,2 мл на 1,0 мл надосадочной жидкости и после тщательного встряхивания содержимого в колбах помещают их в холодильник и выдерживают при температуре 4 С до 18 час, а отделенную бакмассу после промывания стерильной дистиллированной водой и просушивания между слоями фильтровальной бумаги взвешивают и озвучивают трехкратно по 5 мин с интервалом в 3 мин ультразвуком частотой 22 кГц и интенсивностью 100 Вт/см 2,центрифугируют озвученную бакмассу при 5000 об/мин в течение 15 мин, осаждают протеины в надосадочной жидкости 30 трихлоруксусной кислотой из расчета 0,2 мл на 1,0 мл надосадочной жидкости и после тщательного встряхивания содержимого в колбах помещают их в холодильник и выдерживают при температуре 4 С до 18 час и затем смешивают протеины, полученные после трехкратного центрифугирования обработанных 1 раствором трихлоуксусной кислоты осадков из фильтрата и бакмассы, затем смесь протеинов растворяют в трис-буфере и доводят 30 раствором едкого натра рН до 7,1 после чего проводят в течение 48 час диализ в сосичковых оболочках,центрифугируют при 22000 об/мин в течение 20 мин,осадок удаляют, а надосадочную жидкость с доведенной стерильной дистиллированной водой концентрацией белка 1,0 мг/мл разливают в стерильные флаконы и консервируют 0,05 раствором формалина.(72) Басыбеков Советжан Жолдыбекулы Тургенбаев Кайрат Алтынбекович(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский ветеринарный институт Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Научнопроизводственный центр животноводства и ветеринарии Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан(56) Предварительный патент РК 8240, кл. А 61 К 39/04, 1999(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛИНА ИЗ КУЛЬТУРЫ МИКОБАКТЕРИЙ ПТИЧЬЕГО ВИДА(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано для распознавания неспецифической туберкулиновой реакции у животных,обусловленной микобактериями птичьего вида. Технический результат,обеспечиваемый способом, выражается в своевременном и качественном распознавании неспецифической туберкулиновой реакции у животных. Способ получения туберкулина из культуры микобактерий птичьего вида,включающий выращивание культуры микобактерий на жидкой питательной среде,стерилизацию автоклавированием,отделение культуральной жидкости от бакмассы, осаждения протеинов из культуральной жидкости трихлоруксусной кислотой с последующей очисткой целевого продукта, в качестве аллергизируюшего агента используют вирулентную культуру,которую выращивают на жидкой питательной среде Сотона в течение 30 сут, полученную биомассу 20948 Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано для распознавания неспецифической туберкулиновой реакции у животных,обусловленного микобактериями птичьего вида. Известен способ получения аллергена из атипичных микобактерий,включающий выращивание культуры атипичных микобактерий на жидкой питательной среде,стерилизацию автоклавированием,отделение культуральной жидкости от бакмассы, осаждение протеинов из культуральной жидкости трихлоруксусной кислотой с последующей очисткой целевого продукта Предварительный патент РК 8240, кл. А 61 К 39/04, 1999. Недостатком указанного способа является то, что используется вирулентный штамм микобактерий туберкулеза бычьего вида, предназначенный для диагностики туберкулеза у млекопитающих,который проявляет перекрестные гетероаллергические реакции у животных,инфицированных микобактериями птичьего вида. Задачей изобретения является разработка способа получения очищенного высокоактивного и видоспецифического туберкулина из культуры микобактерий птичьего вида. Технический результат,обеспечиваемый способом, выражается в своевременном и качественном распознавании неспецифической туберкулиновой реакции у животных. Способ получения туберкулина из культуры микобактерий птичьего вида,включающий выращивание культуры микобактерий птичьего вида на жидкой питательной среде, стерилизацию автоклавированием,отделение культуральной жидкости от бакмассы, осаждение протеинов из культуральной жидкости трихлоуксусной кислотой с последующей очисткой целевого продукта, в качестве аллергизируюшего агента используют вирулентную культуру,которую выращивают на жидкой питательной среде Сотона в течение 30 сут, полученную биомассу автоклавируют при 120 С в течение 30 мин,отделяют бакмассу от культуральной жидкости фильтрацией через воронку с двойным слоем стерильной фильтровальной бумаги,затем культуральную жидкость упаривают до соотношения 101 на испарителе, полученный концентрат центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин и осаждают из не протеин 30 трихлоруксусной кислотой из расчета 0,2 мл на 1,0 мл надосадочной жидкости и после тщательного встряхивания содержимого в колбах помещают их в холодильник и выдерживают при температуре 4 С в течение 18 час, а отделенную бакмассу после промывания стерильной дистиллированной водой и просушивания между слоями фильтровальной бумаги взвешивают и озвучивают трехкратно по 5 мин с интервалом в 3 мин ультразвуком частотой 22 кГц и интенсивностью 100 Вт/см 2,центрифугируют озвученную бакмассу при 5000 об/мин в течение 15 мин, удаляют осадок,осаждают протеины в надосадочной жидкости 30 2 концентрацией трихлоруксусной кислоты из расчета 0,2 мл на 1,0 мл надосадочной жидкости и после тщательного встряхивания содержимого в колбах помещают их в холодильник и выдерживают при температуре 4 С до 18 час и затем смешивают протеины,полученные после трехкратного центрифугирования обработанных 1 раствором трихлоруксусной кислоты осадков из культуральной жидкости и бакмассы, затем смесь протеинов растворяют в трис-буфере и доводят 30 раствором едкого натра рН до 7,1, после чего проводят в течение 48 час диализ в сосичковых оболочках,центрифугируют при 20000 об/мин в течение 20 мин, осадок удаляют, а надосадочную жидкость с доведенной стерильной дистиллированной водой концентрацией белка 1,0 мг/мл, разливают в стерильные флаконы и консервируют 0,05 раствором нейтрального формалина. Материалом для получения туберкулина из культуры микобактерий птичьего вида является штамм 7800049 В,депонированный в лаборатории Музей культур микроорганизмов ДГП Научноисследовательский ветеринарный институт 0049 В проводят по морфологокультуральным и физиолого-биохимическим свойствам. Морфологические признаки. Микобактерии штамма - грамположительные красные палочки с древовидными окончаниями концов длиной от 0,5 до 3,0 мкм, шириной от 0,1 до 0,5 мкм, подвижные,спор и капсул не образуют. Содержат восковую оболочку, устойчивы к кислоте, спирту и щелочам. Размножается простым делением. Культуральные свойства. На специальных питательных средах Гельберга, ЛевенштейнаЙенсена, Петроньяни, Фин-2 и Мордовского при температурах 22, 37 и 45 С, рН 7,0-7,2 с 12 сут вырастают прозрачные, гладкие, подвижные и непигментированные колонии размером 1-6 мм. С возрастом колонии приобретают желтоватый оттенок. На жидкой синтетической среде Сотона образует неподвижную, толстую, иногда сетчатую пленку. Накопление биомассы в количестве 12-15 гр происходит в течение 30-42 сут. Антигенная структура. Содержит большое количество антигенов, общих с ., .и Определены 2 серотипа. Физиолого-биохимические свойства. Облигатной аэроб с присущим паразитизмом. Фагорезистентной штамм, обладающий осмо - и галотолерантностью,не разжижает желатин, не редицирует нитраты и не образует кристаллы. Обладает арилсульфатной,уреазной, никотиноамдазной и дегидронеазной активностью. Мутант,обладающий хемотрофностью (не растущий в условиях с отсутствием органических источников азота). Пробы на каталазу,ниациновый тест и редукцию нитратов отрицательные. Хранение на питательной среде. Предварительно культивируют на плотной питательной среде 20948 Гельберга, затем парафинируют эбонитовые пробки и хранят при температуре 4 С в течение 3 мес,максимальная продолжительность сохранения жизнеспособности хорошая,при хранении наблюдается незначительное уменьшение количества жизнеспособных клеток. Изобретение осуществляется следующим образом. Пример 1. При получении туберкулина из штамма 780 0049 В первоначально производят засев в 3-пробирки с яичной питательной средой Гельберга. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37-38 С в течение 7-10 сут. Выращенную культуру в пробирках просматривают на чистоту, типичность роста микобактерий птичьего вида и производят отсев с характерного сплошного роста на 3 малые колбы емкостью 500 мл с содержанием картофельной среды Павловского, которые инкубируют в течение 7-10 сут при температуре 37-38 С. Культура из содержимого малых колб в дальнейшем служит исходным материалом для получения биомассы при приготовлении микросерии туберкулина. Пересевается культура один раз в три месяца,хранится при температуре 2-4 С и используется в течение 12 месяцев. Выращивание культуры в 8-10 больших колбах емкостью 3 л с жидкой синтетической средой Сотона, содержащей -аспарагин, производят путем засева специальной платиновой или вольфрамовой петлей на ее поверхность бактериальной пленки,образующейся в питательном субстрате картофельной суспензии в малых колбах, таким образом, чтобы перенесенная пленка свободно плавала на поверхности жидкой среды Сотона. Колбы со средой Сотона после засева 5-6 экземпляров бактериальной пленки выдерживают при 37-38 С в течение 21-28 сут, затем просматривают их на чистоту и форму образования сплошной обильной и морщинистой бактериальной пленки на поверхности среды Сотона. Чистоту и характер роста культуры микобактерий птичьего вида определяют макроскопически и выборочно из трех колб с чистым ростом - микроскопией мазков,окрашенных по Грамму и Циль-Нильсену. Колбы с чистым, типичным и обильным ростом отбирают для получения туберкулина, а со слабым ростом или с проростом посторонней микрофлорой - бракуют. Полученную биомассу с целью денатурации высокомолекулярных белков автоклавируют при 120 С (1 атм) в течение 30 мин, отделяют бакмассу от культуральной жидкости в боксе фильтрацией через воронку с двойным слоем фильтровальной бумаги, затем культуральную жидкость упаривают до соотношения 101 на испарителе, полученный концентрат центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин и осаждают из не протеин 30 концентрацией трихлоруксусной кислоты из расчета 0,2 мл на 1,0 мл надосадочной жидкости и после тщательного встряхивания содержимого в колбах помещают их в холодильник и выдерживают при температуре 4 С в течение 18 час, а отделенную бакмассу после промывания стерильной дистиллированной водой и просушивания между слоями фильтровальной бумаги взвешивают и озвучивают на аппарате УЗДН -2 трехкратно по 5 мин с интервалом в 3 мин ультразвуком частотой 22 кГц и интенсивностью 100 Вт/см 2,центрифугируют озвученную бакмассу при 5000 об/мин в течение 15 мин и затем смешивают протеины, полученные из фильтрата и бакмассы,затем смесь протеинов растворяют в трис(оксиметилом) - буфере и доводят рН до 7,130 раствором едкого натра, после чего проводят в течение 48 час диализ в сосичковых оболочках,центрифугируют при 22000 об/мин, осадок удаляют,а надосадочную жидкость с доведенной стерильной дистиллированной водой концентрацией белка 1,0 мг/мл, разливают в стерильные флаконы и консервируют 0,05 раствором нейтрального формалина. Пример 2. Проверку на стерильность препарата осуществляют путем посева его следующие среды МПА, МПБ, МППБ и среду Чапека. На каждую среду в пяти пробирках высевали по 0,3 мл опытного туберкулина, растворенного тем же объемом стерильного физиологического раствора. Посевы выдерживали в термостате в течение 10 сут при температуре 37-38 С для МПА, МПБ, МППБ и при 20-22 С - для среды Чапека. Через 10 сут все пробирки были чистыми, что свидетельствовало о стерильности данного препарата. Пример 3. Проверка на безвредность препарата проводилась на 5 особях здоровых мышей, которым вводили подкожно опытный туберкулин в объеме 0,25 см 3,растворенный в стерильном физиологическом растворе такого же объема. Пять особей белых мышей были контрольными (им не вводили туберкулин). В течение 10 сут все белые мыши, которым вводился туберкулин, оставались здоровыми, на месте введения данного туберкулина не было отмечено никаких изменений, что указывало на его безвредность для лабораторных животных. Пример 4. Отсутствие сенсибилизирующих свойств опытного туберкулина проверялось на 6 здоровых морских свинках. Трем особям вводили трехкратно по 500(международных единиц) препарата в объеме 0,1 см 3 стерильного физиологического раствора с интервалом 5 сут, а три особи служили контролем. Через 15 сут всем морским свинкам вводили внутрикожно по 500 туберкулина, растворенного в 0,1 см 3 стерильного физиологического раствора. Учет реакции проводили через 24 час после введения препарата. Реакция на введение данного туберкулина у первых трех морских свинок почти не отличалась, за исключением незначительной гиперемии размером не более 5 мм, от реакции у трех контрольных свинок. Пример 5. Полученный туберкулин стандартизируют по содержанию белка (1,0 мг/мл), после чего используют в качестве аллергена. Предлагаемый туберкулин проверяют на чувствительность и специфичность в опытах на 3 20948 морских свинках. В качестве контроля использовали ППД - туберкулины для млекопитающих и птиц. Биологическую активность опытного туберкулина определяли методом серийных разведений на морских свинках, предварительно зараженных культурой. Препарат вводят внутрикожно в количестве 0,0005 мг, 0,0001 мг,0,00002 мг в 0,1 см 2 физиологического раствора,сравнивая их со стандартными ППД-туберкулинами для млекопитающих и птиц в разведениях 25,5 и 1. Результаты учитывали через 24 и 48 час путем измерения образовавших папул,которые представлены в таблице 1. Количествов 1 мг опытной микросерии сенситина в сравнении со стандартной серией ППДтуберкулина для птиц определяли по формуле реакций у морских свинок на стандартный ППДтуберкулин для птиц, Б - сумма интенсивности реакций у морских свинок на испытуемый туберкулин для птиц. Производя соответствующие расчеты с учетом отношения показателя Б к показателю А в опытной группе морских свинок, зараженных М. , было определено, что содержаниев 1,0 мл испытуемых микросериях гомологичного туберкулина равнялось соответственно 25400 и 29637. Отсюда следует, что содержаниев 1 мг данного сенситина второй микросерии превышало(на 4 тыс. 237) такового показателя первой микросерии, что свидетельствовало об относительно выраженной активности сенситина этой микросерии. Наблюдаемое расхождение в количествемежду стандартной серией птичьего туберкулина и испытуемыми микросериями данного аллергена находилось в пределах допустимой нормы, равной 20. Результаты опыта на лабораторных животных по определению специфичности двух микросерий опытного туберкулина представлены в таблицах 2 и 3. Установлено, что у всех опытных животных наблюдалась выраженность гомологичных реакций на испытуемые микросерии аллергена,приготовленного из ., и на туберкулин для птиц стандартной серии при наличии перекрестных гетероаллергических реакций на туберкулин для млекопитающих,что указывает на близкородственное антигенное родство этой культуры микобактерий птичьего вида с истинными возбудителями туберкулеза. Полученные данные свидетельствуют об относительно высокой специфичности обеих микросерий испытуемого туберкулина для птиц. Таким образом, способ получения очищенного видоспецифического туберкулина из культуры микобактерий птичьего вида обеспечивает (по сравнению с известным способом) получение гомологичного аллергена,обладающего достаточной активностью и высокой специфичностью, использование предлагаемого способа позволит надежно и качественно распозновать неспецифическую туберкулиновую чувствительность у животных,что дает значительный эффект развитию животноводства в силу предотвращения неоправданного убоя практически здорового,племенного и высокопродуктивного скота и необоснованного проведения противотуберкулезных мероприятий. Таблица 1 Учет интенсивности аллергических реакций у морских свинок через 24 и 48 часов после введения оттитрованных доз стандартной серии ППД - туберкулина для птиц и испытуемой серии опытного туберкулина, приготовленного из М.Вид зараженной культуры атипичных микобактерий Интенсивность аллергических реакций (в мм) на введение определенных разведений аллергенов ППД- туберкулина для птиц опытный туберкулин для птиц стандартной серии испытуемой серии 1 ТЕ 5 ТЕ 25 ТЕ 125 0,00002 0,0001 0,0005 0,0025 24 48 ч 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч ч 6 5 7 6 9 7 6 5 9 8 11 9 7 5 9 8 10 9 7 6 11 9 12 10 5 8 7 10 8 5 10 9 11 9 20948 Таблица 2 Интенсивность реакций на опытный туберкулин 2- микросерии и туберкулины для млекопитающих и птиц у морских свинках, зараженных М.(1- опыт) Вид Номера зараженной бирок у культуры морсмикобакких терий свинок М.12 13 14 М Размеры папулы (в мм) на аллергены Туберкулин из М.ППД-туберкулины для 1-й м/серии 2-й м/серии птиц млекопитающих через через через через через через через через 24 ч. 48 ч. 24 ч. 48 ч. 24 ч. 48 ч. 24 ч. 48 ч. 8 10 10 9 9 8 5 8 6 10 8 8 7 5 7 6 9 7 7 6 7,6 6,3 9,3 8 8 7 3,3 Таблица 3 Интенсивность реакций на опытный туберкулин 2-х микросерий и туберкулины для млекопитающих и птиц у морских свинках, зараженных М.(2- опыт) Вид Номера Размеры папулы (в мм) на аллергены зараженной бирок у Туберкулин из М.ППД-туберкулины для культуры морс 1 -й м/серии 2-й м/серии птиц млекопитающих микобакких через через через через через через через через терий свинок 24 ч. 48 ч. 24 ч. 48 ч. 24 ч. 48 ч. 24 ч. 48 ч. М.15 11 10 12 11 9 8 6 16 10 11 11 10 8 7 6 17 9 8 11 10 8 7 5 18 10 8 11 10 9 8 5 Мм 10,00,4 8,70,58 11,20,5 10,20,25 8,50,28 7,50,28 5,50,28 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения моновидового сенситина из нефотохромогенной культуры атипичных микобактерий, включающий выращивание культуры микобактерий на жидкой питательной среде,стерилизацию автоклавированием,отделение культуральной жидкости от бакмассы, осаждение протеинов из культуральной жидкости трихлоруксусной кислотой с последующей очисткой продукта, отличающийся тем, что в качестве культуры микобактерий используют вирулентную культуру, которую выращивают на жидкой питательной среде Сотона в течение 30 сут, полученную биомассу автоклавируют при 120 С в течение 30 мин, отделяют бакмассу от культуральной жидкости фильтрацией через воронку с двойным слоем стерильной фильтровальной бумаги, затем культуральную жидкость упаривают до соотношения 101 на испарителе,полученный концентрат центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин и осаждают из не протеин 30 трихлоруксусной кислотой из расчета 0,2 мл на 1,0 мл надосадочной жидкости и после тщательного встряхивания содержимого в колбах помещают их в холодильник и выдерживают при температуре 4 С до 18 час, а отделенную бакмассу после промывания стерильной дистиллированной водой и просушивания между слоями фильтровальной бумаги взвешивают и озвучивают трехкратно по 5 мин с интервалом в 3 мин ультразвуком частотой 22 кГц и интенсивностью 100 Вт/см 2,центрифугируют озвученную бакмассу при 5000 об/мин в течение 15 мин, удаляют осадок, осаждают протеины в надосадочной жидкости 30 концентрацией трихлоруксусной кислоты из расчета 0,2 мл на 1,0 мл надосадочной жидкости и после тщательного встряхивания содержимого в колбах помещают их в холодильник и выдерживают при температуре 4 С до 18 час, затем смешивают протеины, полученные после трехкратного центрифугирования обработанных 1 раствором трихлоруксусной кислоты осадков из культуральной жидкости и бакмассы, смесь протеинов растворяют в трисбуфере и доводят 30 раствором едкого натра рН до 7,1, после чего проводят в течение 48 час диализ в сосичковых оболочках, центрифугируют при 22000 об/мин в течение 20 мин, осадок удаляют, а надосадочную жидкость с доведенной стерильной дистиллированной водой концентрацией белка 1,0 мг/мл разливают в стерильные флаконы и консервируют 0,05 раствором нейтрального формалина.