Способ получения бруцеллезного антигена для изготовления диагностической сыворотки

(51) 61 39/10 (2006.01) 61 10/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Технический результат, обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении специфичности,чувствительности, иммуногенности и стандартизуемости получаемого антигена без значительных изменений его антигенной структуры. Способ получения бруцеллезного антигена для изготовления диагностической сыворотки, включающий приготовление посевного материала штамма бруцелл, его культивирование, отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток,их инактивирование нагреванием с последующим ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацию конечного продукта, достигается тем, что в качестве посевного материала используют вакцинный штамм-1,который смывают физиологическим раствором,фильтруют при помощи стерильной марли, затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин,надосадочную жидкость сливают, а из осадка готовят 50 млрд. м.к./см 3 взвесь бруцелл, которую инактивируют 0,25 раствором формальдегида в течение 30- мин, после чего добавляют левамизол из расчета 30,0 г на 1 литр бактериальной взвеси и получают целевой продукт.(72) Мустафин Муафик Кометаевич Аубакирова Алма Колубаевна Михалев Александр Николаевич Тен Виктор Борисович Жанбырбаев Мухтар Жанбырбаевич(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научно-исследовательский ветеринарный институт Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Научно-производственный центр животноводства и ветеринарии Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан(56) Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования./ Под редакцией М.О.Биргера.- М. Медицина, 1982. - с.52(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано при производстве биопрепаратов для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. 19905 Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано при производстве биопрепаратов для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Известен способ изготовления бруцеллезного антигена для получения диагностической сыворотки, включающий приготовление посевного материала штамма бруцелл, его культивирование,отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток, их инактивирование нагреванием с последующим ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацию конечного продукта Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования./ Под ред. М.О.Биргера. - М. Медицина, 1982.-с.52. Недостатком данного способа является то, что изготовленный антиген не имеет высоких качественных показателей. Задачей изобретения является разработка бруцеллезного антигена с более высокими качественными характеристиками. Технический результат, обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении специфичности,чувствительности, иммуногенности и стандартизуемости получаемого антигена без значительных изменений его антигенной структуры. Способ получения бруцеллезного антигена для изготовления диагностической сыворотки, включающий приготовление посевного материала штамма бруцелл, его культивирование, отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток,их инактивирование нагреванием с последующим ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацию конечного продукта., достигается тем, что в качестве посевного материала используют вакцинный штамм-1,который смывают физиологическим раствором,фильтруют при помощи стерильной марли, затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин,надосадочную жидкость сливают, а из осадка готовят 50 млрд. м.к./см 3 взвесь бруцелл, которую инактивируют 0,25 раствором формальдегида в течение 30- мин, после чего добавляют левамизол из расчета 30,0 г на 1 литр бактериальной взвеси и получают целевой продукт. Вакцинный штамм-1 используют для изготовления бруцеллезного антигена. Указанный штамм бактерий депонирован в лаборатории Музей культур микроорганизмов ДГП Научно-исследовательский ветеринарный институт (КазНИВИ). Идентификацию штамма бактерий вида-1 проводят по морфологическим,культуральным и физиолого- биохимическим свойствам. Морфологические признаки. Бактерии штамма грамотрицательные, овоиды от 0,4-2,2 х 0,4-0,6 мкм,неподвижные, спор и капсул не образуют. Культуральные свойства. На эритрит-агаре вырастают круглые, гладкие, плотные колонии, форма, в проходящем свете янтарные, прозрачные. Накопление бакмассы наблюдают через 24-48 час 2 выращивания. В питательном бульоне бруцеллы образуют равномерную муть с пристеночным кольцом. Аэробы. Оптимальная температура выращивания 37 С, рН 6,8-7,0. Биохимические свойства. Обладают уреазной и оксидазной активностью. Проба на диссоциацию. По Уайт-Вилсону колонии окрашиваются в желтый цвет с синим окаймление (-форма). Проба с трипафлавином (1500) и реакция термоагглютинации отрицательные. Антигенная структура. Содержат типичный набор антигенных детерминант, характерных для форм бруцелл, т.е. агглютинируются -антибруцеллезной сывороткой и не вступают в реакцию с антибруцеллезной сывороткой. Патогенные свойства. При определении вирулентности по методу Коротича-Голота установлено,что штамм-1 имеет низкую вирулентность. Серологические свойства. Антиген из бруцелл данного штамма обладает высокой диагностической эффективностью при исследовании сыворотки крови животных. Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотроф. Тип катаболизма - аэроб. Оптимальый рН 6,8-7,2. Источники углерода -глюкоза и эритрит. Источники азота -аланин, -аланин, -аспарагин, -глутаминовая кислота, гидролизаты животных белков. Источники серы цистин. Биохимические маркерные признаки обладает уреазной и оксидазной активностью. Физиологические маркерные признаки хемоорганотроф, не растет без органических источников азота, стрептомицинзависим. Хранение на питательной среде. Предварительно культивируют на эритрит-агаре при оптимальной температуре в аэробных условиях,хранят при температуре 4-6 С в течение 6 мес.,максимальная продолжительность сохранения жизнеспособности хорошая, при хранении наблюдается остановка роста. Способ получения бруцеллезного антигена для изготовления диагностической сыворотки заключается в следующем. Пример 1. Засевают 1-2 бактериологических петли культуры бактерий штамма-1 на пробирки со скошенным эритрит-агаром. 3-4 суточную бруцеллезную культуру смывают физиологическим раствором, фильтруют при помощи стерильной марли, для осаждения бактериальной массы центрифугируют 30 минут при 5 тысяч об/мин. Надосадочную жидкость сливают. Из осадка готовят 50 млрд. м.к./см 3 взвесь,которую инактивируют 0,25 раствором формальдегида в течение 30- мин. Пример 2. Для проверки инактивирующего действия тепловой обработки используют отмытую суспензию штамма бактерий 1. Контролем служит взвесь бруцелл, не подвергшаяся тепловой обработке. Суспензию 19905 бруцелл нагревают на водяной бане до температуры 80 С и через определенные промежутки времени(10, 15, 20 30, 45 мин, 1, 2 ч) делают высев бруцелл из раствора, подвергшегося и не подвергшегося тепловой обработке на твердую питательную среду. Результаты учитывают через 3 сут выращивания в термостате при 37 С. Полученные данные приведены в таблице 1. Из таблицы 1 видно, что инактивация бруцелл штамма-1 происходит уже через 30 мин после взаимодействия с 0,25 раствором формальдегида. Рост бруцелл, не подвергшихся обработке наблюдают в течение 3 сут. Полученные результаты доказывают возможность инактивации бруцелл-1 для приготовления диагностических препаратов 0,25 раствором формальдегида. Пример 3. Для приготовления антигенной композиции отмытые инактивированные клетки бактерий штамма-1 ресуспендируют в буферном разбавителе до получения 50 млрд. м.к./см 3 взвеси, добавляют 0,03 г левамизола,шуттеллируют в течение 30 мин. Пример 4. Для проверки антигигенной активности антигенных композиций было создано 2 группы кроликов по 3 головы в каждой. Первой группе животных вводили 50 млрд. м.к./см 3 инактивированных нагреванием бактерий штамма-1 с добавлением 0,03 г левамизола Второй группе животных вводили 50 млрд. м.к./см 3 бактерий штамма-1. Названные дозы препаратов были приготовлены на физиологическом растворе в конечном объеме 2 см 3, после чего иннокулируемая доза каждого препарата была разделена на 2 части. Первую часть(1 см 3) вводили кроликам подкожно в районе подгрудка. Вторую часть (1 см 3) вводили одновременно с первой, но в области брюшка. Для изучения динамики антителообразования у всех животных были взяты образцы крови из ушной вены через 10, 20 и 30 дней после иммунизации. Сыворотку крови получали методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживали 30-60 минут при 20-30 С, сгустки от стенки отделяли стальной спицей, а затем пробирки выдерживали при 4-10 С. Через 2-24 часа отстоявшуюся сыворотку сливали в сухие стерильные пробирки. Образцы сыворотки исследовались на содержание бруцеллезных антител серологически в РДСК. Полученные данные приведены в таблице 2. Из таблицы 2 видно, что через 10, 20 и 30 дней после иммунизации иммуногенная активность инактивированных антигенных композиций с добавлением иммуностимулятора превышает по средним титрам при серологическом исследовании в РДСК иммуногенную активность живых бактерий штамма-1. Таким образом, антигенные композиции, приготовленные из инактивированных клеток бруцелл с добавлением иммуностимулятора можно применять для получения гипериммунных бруцеллезных сывороток для приготовления диагностических средств. Таблица 1 Результаты действия 0,25 раствора формальдегида на бактерий штамма-1 Инактивирующее воздействие 10 мин 0,25 раствор формальдегида. Таблица 2 Сравнительная проверка иммуногенной активности антигенных композиций Наименование Сроки исследования после иммунизации (дни) и динамика иммунизирующего серологических титров в РДСК,препарата 10 20 30 антиген антиген антиген антиген антиген антиген Антигенная ком 93,3 3,3 133,3 3,3 186,7 3,3 позиция из штамма-1 Живая вакцина из 66,7 3,3 133,3 5,0 133,3 5,0 штамма Способ получения бруцеллезного антигена для изготовления диагностической сыворотки, вклю чающий приготовление посевного материала штамма бруцелл, его культивирование, отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток,их инактивирование нагреванием с последующим 3 19905 ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацию конечного продукта, отличающийся тем, что в качестве посевного материала используют вакцинный штамм-1,который смывают физиологическим раствором, фильтруют при помощи стерильной марли, затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин, надосадочную жидкость сливают, а из осадка готовят 50 млрд. м.к./см 3 взвесь бруцелл,которую инактивируют 0,25 раствором формальдегида в течение 30 мин, после чего добавляют левамизол из расчета 30,0 г на 1 литр бактериальной взвеси и получают целевой продукт.