Способ получения бруцеллезного антигена для изготовления диагностической сыворотки

(51) 61 39/10 (2006.01) 61 10/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Технический результат, обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении специфичности,чувствительности, иммуногенности и стандартизуемости получаемого антигена без значительных изменений его антигенной структуры. Способ получения бруцеллезного антигена для изготовления диагностической сыворотки, включающий приготовление посевного материала штамма бруцелл, его культивирование, отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток,их инактивирование нагреванием с последующим ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацию конечного продукта, достигается тем, что в качестве посевного материала используют вакцинный штамм 82, который смывают физиологическим раствором, фильтруют при помощи стерильной марли, затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин,надосадочную жидкость сливают, а из осадка готовят 50 млрд. м.к./см 3 взвесь бруцелл, которую инактивируют 0,25 раствором формальдегида в течение 30 мин, после чего добавляют левамизол из расчета 30,0 г на 1 литр бактериальной взвеси и получают целевой продукт.(72) Тен Виктор Борисович Мустафин Батыржан Муафикович Даулетьярова Айжан Сагитовна Дюсенов Сайран Мырзаханович Есимова Жумазия(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научно-исследовательский ветеринарный институт Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Научно-производственный центр животноводства и ветеринарии Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан(56) Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования./ Под редакцией М.О. Биргера,- М. Медицина, 1982. - с.52(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано при производстве биопрепаратов для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. 19906 Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано при производстве биопрепаратов для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Известен способ изготовления бруцеллезного антигена для получения диагностической сыворотки, включающий приготовление посевного материала штамма бруцелл, его культивирование,отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток, их инактивирование нагреванием с последующим ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацию конечного продукта Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования./ Под ред. М.О. Биргера. - М. Медицина, 1982.-с.52. Недостатком данного способа является то, что изготовленный антиген не имеет высоких качественных показателей. Задачей изобретения является разработка бруцеллезного антигена с более высокими качественными характеристиками. Технический результат, обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении специфичности,чувствительности, иммуногенности и стандартизуемости получаемого антигена без значительных изменений его антигенной структуры. Способ получения бруцеллезного антигена для изготовления диагностической сыворотки, включающий приготовление посевного материала штамма бруцелл, его культивирование, отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток,их инактивирование нагреванием с последующим ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацию конечного продукта., достигается тем, что в качестве посевного материала используют вакцинный штамм 82, который смывают физиологическим раствором, фильтруют при помощи стерильной марли, затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин,надосадочную жидкость сливают, а из осадка готовят 50 млрд. м.к./см 3 взвесь бруцелл, которую инактивируют 0,25 раствором формальдегида в течение 30 мин, после чего добавляют левамизол из расчета 30,0 г на 1 литр бактериальной взвеси и получают целевой продукт. Вакцинный штамм 82 используют для изготовления бруцеллезного антигена. Указанный штамм бактерий депонирован в лаборатории Музей культур микроорганизмов ДГП Научно-исследовательский ветеринарный институт (КазНИВИ). Идентификацию штамма бактерий вида 82 проводят по морфологическим, культуральным и физиолого- биохимическим свойствам. Морфологические признаки. Бактерии штамма грамотрицательные, овоиды от 0,4-2,2 х 0,4-0,6 мкм,неподвижные, спор и капсул не образуют. Культуральные свойства. На эритрит-агаре вырастают круглые, гладкие, плотные колонии, форма, в проходящем свете янтарные, прозрачные. Накопление бакмассы наблюдают через 24-48 час выращивания. В питательном бульоне бруцеллы образуют равномерную муть с пристеночным 2 кольцом. Аэробы. Оптимальная температура выращивания 37 С, рН 6,8-7,0. Биохимические свойства. Обладают уреазной,оксидазной, каталазной активностью. Проба на диссоциацию. По Уайт-Вилсону колонии окрашиваются как -форма. Патогенные свойства. При определении вирулентности по методу Коротича-Голота установлено,что штамм 82 имеет низкую вирулентность. Серологические свойства. Антиген из бруцелл данного штамма обладает высокой диагностической эффективностью при исследовании сыворотк крови животных. Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотроф. Тип катаболизма- аэроб. Оптимальный рН 6,8-7,0. Источники углерода -галактоза, -глюкоза, рибоза и эритрит. Источники азота -аланин, -аланин, аспарагин, -глутаминовая кислота, гидролизаты животных белков. Источники серы цистин. Биохимические маркерные признаки обладает оксидазной и цистеиндисульфгидразной активностью. Физиологические маркерные признаки хемоорганотроф, не растет без органических источников азота, требуется наличие СО 2 для роста, не растет на питательных средах содержащих пенициллин. Хранение на питательной среде. Предварительно культивируют на эритрит-агаре при оптимальной температуре в аэробных условиях,хранят при температуре 4-6 С в течение 6 мес.,максимальная продолжительность сохранения жизнеспособности хорошая, при хранении наблюдается остановка роста. Способ получения бруцеллезного антигена для изготовления диагностической сыворотки заключается в следующем. Пример 1. Засевают 1-2 бактериологических петли культуры бактерий штамма 82 на пробирки со скошенным эритрит-агаром. 3-4 суточную бруцеллезную культуру смывают физиологическим раствором, фильтруют при помощи стерильной марли, для осаждения бактериальной массы центрифугируют 30 минут при 5 тысяч об/мин. Надосадочную жидкость сливают. Из осадка готовят 50 млрд. м.к./см 3 взвесь,которую инактивируют 0,25 раствором формальдегида в течение 30- мин. Пример 2. Для проверки инактивирующего действия 0,25 раствора формальдегида используют отмытую суспензию штамма бактерий 82. Контролем служит физиологический раствор (0,85 раствор хлористого натрия). К суспензии бруцелл добавляют раствор формальдегида до 0,25 и через определенные промежутки времени (10, 15, 20 30, 45 мин, 1, 2 ч) делают высев бруцелл из раствора с инактивирующим агентом и физиологическим раствором на твердую питательную среду. Результаты учитывают через 3 сут 19906 выращивания в термостате при 37 С. Полученные данные приведены в таблице 1. Как видно из таблицы 1 инактивация бруцелл происходит уже через 30 мин после взаимодействия с 0,25 раствором формальдегида. Рост бруцелл,суспендированных в физиологическом растворе наблюдают в течение 3 сут. Полученные результаты доказывают возможность инактивации бруцелл 82 для приготовления диагностических препаратов 0,25 раствором формальдегида. Пример 3. Для приготовления антигенной композиции отмытые инактивированные клетки бактерий штамма 82 ресуспендируют в буферном разбавителе до получения 50 млрд. м.к./см 3 взвеси, добавляют 0,03 г левамизола, шуттеллируют в течение 30 мин. Пример 4. Для проверки антигигенной активности антигенных композиций было создано 2 группы кроликов по 3 головы в каждой. Первой группе животных вводили 50 млрд. м.к./см 3 инактивированных 0,25 раствором формальдегида бактерий штамма 82 с добавлением 0,03 г левамизола Второй группе животных вводили 50 млрд. м.к./см бактерий штамма 82. Названные дозы препаратов были приготовлены на физиологическом растворе в конечном объеме 2 см 3, после чего иннокулируемая доза каждого препарата была разделена на 2 части. Первую часть(1 см 3) вводили кроликам подкожно в районе подгрудка. Вторую часть (1 см 3) вводили одновременно с первой, но в области брюшка. Для изучения динамики антителообразования у всех животных были взяты образцы крови из ушной вены через 10, 20 и 30 дней после иммунизации. Сыворотку крови получали методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживали 30-60 минут при 20-30 С, сгустки от стенки отделяли стальной спицей, а затем пробирки выдерживали при 4-10 С. Через 2-24 часа отстоявшуюся сыворотку сливали в сухие стерильные пробирки. Образцы сыворотки исследовались на содержание бруцеллезных антител серологически в РДСК. Полученные данные приведены в таблице 2. Из таблицы 2 видно, что через 30 дней после иммунизации иммуногенная активность инактивированных антигенных композиций с добавлением иммуностимулятора превышает по средним титрам при серологическом исследовании в РДСК иммуногенную активность живых бактерий штамма 82. Таким образом, антигенные композиции, приготовленные из инактивированных клеток бруцелл с добавлением иммуностимулятора можно применять для получения гипериммунных бруцеллезных сывороток для приготовления диагностических средств. Таблица 1 Результаты действия 0,25 раствора формальдегида на штамм 82 Инактивирующее воздействие 10 мин 0,25 раствор формальдегида Таблица 2 Сравнительная проверка иммуногенной активности антигенных композицийгрупп Антигенная композиция из штамма 82 Живая вакцина из штамма Сроки исследования после иммунизации (дни) и динамика серологических титров в РДСК,10 20 30 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения бруцеллезного антигена для изготовления диагностической сыворотки, включающий приготовление посевного материала штамма бруцелл, его культивирование, отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток,их инактивирование нагреванием с последующим ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацию конечного продукта, отличаю 3 19906 щийся тем, что в качестве посевного материала используют вакцинный штамм 82,который смывают физиологическим раствором,фильтруют при помощи стерильной марли, затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин. надосадочную жидкость сливают, а из осадка готовят 50 млрд. м.к/см 3 взвесь бруцелл, которую инактивируют 0,25 раствором формальдегида в течение 30 мин, после чего добавляют левамизол из расчета 30,0 г на 1 литр бактериальной взвеси и получают целевой продукт.