Способ изготовления аллергена для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных

(51) 61 39/10 (2006.01) 61 10/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Технический результат, обеспечиваемый изобретением, выражается в большей выявляемости зараженных бруцеллезом животных и ускорением сроков оздоровления неблагополучных по бруцеллезу хозяйств. Способ изготовления аллергена для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных,включающий выращивание культуры бруцелл на твердой питательной среде,их смыв,центрифугирование и ресуспендирование осадка, в качестве антигена используют штамм 19, содержащий в своем составе - формы бруцелл, который доводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 100 млрд. микробных клеток в 1,0 мл, затем ее центрифугируют при 5000 об/мин в течение 40 мин,осадок удаляют, а надосадок сливают в стерильную посуду и автоклавируют при 1 атм в течение 30 мин и оставляют при комнатной температуре на 2-3 сут.,затем фильтруют через стерилизующие пластины после чего, полученный фильтрат разводят в 10 раз 0,85 физиологическим раствором, добавляют формалин до объема 0,2 и получают целевой продукт.(72) бутлп спен Алпысбаева Сабира Егизбаевна Мырзалиев Ахан Жахангериович Канатбаев Серик Ганиевич Базарбаев Марат Есимова Жумазия Нурмаганбетовна Тоганаев Жунисбек Калдыбаевич Даулетьярова Айжан Сагитовна Дюсенов Сайран Мырзаханович Оспанов Галым Хамиевич(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научно-исследовательский ветеринарный институт Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Научно-производственный центр животноводства и ветеринарии Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан(56) Иванов Н.П. Бруцеллез животных методы и средства борьбы с ним. Алматы, 2002, с.322-326(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ 19907 Изобретение относится к ветеринарии, в частности, к приготовлению препаратов и способам диагностики бруцеллеза сельско-хозяйственных животных. Известен способ изготовления аллергена для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных, включающий выращивание культуры бруцелл на твердой питательной среде, их смыв,центрифугирование и ресуспендирование осадка,воздействие ультразвуками волнами, автоклавирование, удаление осадка центрифугированием,стерилизация надосадочный жидкости и определение доли общего белка Иванов Н.П. Бруцеллез животных методы и средства борьбы с ним / Алматы, 2002, с. 322-326. Недостатком данного способа является сложность технологии изготовление и невысокая чувствительность аллергена при исследовании больных бруцеллезом животных. Задачей изобретения является разработка способа изготовления аллергена, позволяющего сократить время приготовления, а также повышение его чувствительности при диагностике бруцеллеза животных. Технический результат, обеспечиваемый изобретением, выражается в большей выявляемости зараженных бруцеллезом животных и ускорением сроков оздоровления неблагополучных по бруцеллезу хозяйств. Способ изготовления аллергена для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных,включающий выращивание культуры бруцелл на твердой питательной среде,их смыв,центрифугирование и ресуспендирование осадка, в качестве антигена используют штамм 19, содержащий в своем составе - формы бруцелл, который доводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 100 млрд. микробных клеток в 1,0 мл, затем ее центрифугируют при 5000 об/мин в течение 40 мин,осадок удаляют, а надосадок сливают в стерильную посуду и автоклавируют при 1 атм в течение 30 мин и оставляют при комнатной температуре на 2-3 сут,затем фильтруют через стерилизующие пластины после чего, полученный фильтрат разводят в 10 раз 0,85 физиологическим раствором, добавляют формалин до объема 0,2 и получают целевой продукт. При изготовлении аллергена для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных используют культуру 19, содержащий в своем составе - формы бруцелл. Штамм 19 депонирован в депозиторе ДГП НИВИ 28 декабря 2006 г. Штамм 19 характеризуется следующими признаками. Происхождение Штамм 19 получен 1923 г в США из молока коровы. Идентифицирован по определителью бактерий Берджи, М. 1997, т.1, С. 81-82. Сравнн с типовым штаммом коллекционныйВ-0027 В.544 (эталонный). Штамм получен путем отбора колоний в -форме. Штамм 2 при серологической типизации с -бруцеллезной и моноспецифической антиабортусной сыворотками дает позитивные реакции, а с моноспецифической антимелитензисной и - бруцеллезной сыворотками-негативную реакцию. Биотехнологические характеристики Штамм типовой,слабовирулентный,для приготовления вакцинных и диагностических препаратов. Хорошо растет в агаре Д, эритритагаре, МПА, МППГГА, не растет на средах с добавлением пенициллина в дозе 2,5-5 ЕД/мл среды. Растет на среде с добавлением фуксина (150000) и не растет на среде с тионином (125000 и 150000). Проба с трипафлавином (1500) и реакция термоагглютинации отрицательные. Морфолого-культуральные свойства Хорошо растет на эритрит-агаре, Т 37-38 С,48 час в термостате овоиды, длина 0,4-2,5 мкм,ширина 0,4-0,6 мкм очертания концов округлые,грамотрицательные, кислотонеустойчив, неподвижные, тип клеточной стенки липополисахарид,специализированные клетки не образует, колоний плотные, гладкие, поверхность блестящая, -форма. Физиолого-биохимические свойства Хемоорганотроф, аэроб, тип катаболизмадыхание, внутриклеточный паразит, чувствителен к пенициллину 2,5-5 ЕД/мл среды,рост стимулируется добавлением крови и сыворотки,источник углерода - глюкоза, глицерин, источник серы - цистин, обладает уреазной, оксидазной,каталазной активность, образует 2, желатин не разжижает, индол не образует, не лизирует эритроциты, не образует ацетилметилкарбинол,выявляются иммунохимическими методами - РА,РСК, ИФА, ПЦР, слабопатогенен для животных. Изобретения осуществляется следующим образом. Пример 1. Культуру 19,содержащий в своем составе - формы бруцелл выращивают на твердой питательной среде в течение 3 сут. с последующем их смывом 0,5 фенолизированным физиологическим раствором,полученную бактериальную массу фильтруют через тройной марлевый фильтр, затем взвесь бруцелл стерильной дистиллированной водой доводят до концентрации 100 млрд. микробных клеток в 1,0 см 3. Далее суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 40 мин, осадок удаляют, а надосадок сливают в стерильную посуду и автоклавируют при 1 атм в течение 30 мин и оставляют при комнатной температуре на 2-3 сут,затем фильтруют через стерилизующие пластины,полученный фильтрат разводят в 10 раз 0,85 физиологическим раствором, в качестве консерванта добавляют формалин до объема 0,2 и используют в качестве целевого продукта. Пример 2. Определение стерильности аллергена проводят путем высева на эритрит-агар и мясопептонной бульон. В результате проведенных исследований высевы оставались в течение 10 дней (период наблюдения) стерильными, что свидетельствуют об отсутствии бактериальной загрязненности аллергена. 19907 Пример 3. Для испытания безвредности из общей пробы аллергена стерильной пипеткой берут 3-4 см 3 и вводят подкожно по 0,5 см 3 5 белым мышам массой 18-20 г в области паха. При этом аллерген не вызывал воспалительных реакции на месте введения, общее состояния животных были нормальное, случаи их заболевания и гибели в течение 10 дней не отмечено, что свидетельствуют о безвредности испытуемого аллергена. Пример 4. Определение специфичности предлагаемого аллергена проводят на 10 здоровых морских свинках массой 350-600 г, путем внутрикожного введения 0,1 см 3 аллергена в депиллированный участок на боковой поверхности туловища. Одновременно на симметричном участке другой стороны туловища вводят по 0,1 см 3 противопоставляемого аллергена. Учет реакции проводят через 24-48 час. При этом оба аллергена не вызвал воспалительной реакции у опытных животных в течение 48 час, что свидетельствуют о специфичности аллергенов. Пример 5. Определение активности проводят на 10 сенсибилизированных морских свинках массой 350-600 г. Сенсибилизируют животных путем подкожного введения двухсуточной агаровой культуры 19 в дозе 1 млрд. микробных клеток по оптическому стандарту мутности ГНИИСК им. Л.А. Тарасовича. Через 28 сут после прививки на морских свинках проводят определение активности аллергена. Животные могут быть использованы в опытах по определению активности не более 6 месяцев с интервалом между испытаниями не менее 28 сут. Предлагаемый и противопоставленный аллерген вводят 10 морским свинкам внутрикожно в депиллированные участки в дозе 0,1 см 3 в разнее стороны туловища. Иглу вводят в складку кожи свинки, зажатую между большим и указательным пальцами,параллельно поверхности кожи с таким расчетом,чтобы не менее 3 мм иглы было погружено в кожу. Затем складку кожи отпускают и нажимом на поршень вводят точно 0,1 см 3 препарата. В месте инъекции должна образоваться выпуклость величиной с горошину. С целью предупреждения вытекания аллергена иглу после введения задерживают на 2-3 сек в коже и затем извлекают. Для введения аллергенов применяют маркированные вместимостью 1 см 3 шприцы, не пропускающие раствор под поршень или иглу. Каждый аллерген вводят отдельным шприцем. Интенсивность реакций проверяют через 48 час после введения аллергенов, измеряя два взаимно перпендикулярных диаметра отеков, образующихся в месте введения и вычисляют среднее значение,которое и является показателем интенсивности реакции. При этом на месте введения аллергенов у морских свинок появлялась воспалительная реакция в виде различной отечной припухлости и гиперемии кожи. Следует отметить, что реакция на предлагаемый и противопоставленный аллерген была аналогичный, что свидетельствуют об их достаточной активности. Пример 6. Для определения специфичности и чувствительности предлагаемого аллергена исследовуют различные по эпизоотологической характеристике группы сельскохозяйственных животных на бруцеллез. Бруцеллезные аллергены вводят мелкому рогатому скоту внутрикожно во внутреннюю поверхность бедра, крупному рогатому скоту и верблюдам в среднюю треть шеи в дозе 0,2 см 3. У больных бруцеллезом животных на месте введения аллергена появляется воспалительная реакция в виде плотного отека с ярко выраженным контуром и достаточно плотной консистенции,обычно хорошо видимого при осмотре. У здоровых животных местная аллергическая реакция не возникает. Реакцию на аллерген у животных учитывают один раз через 48 час путем осмотра и пальпации складки кожи на месте введения препарата в сравнении с нормальным участком тела. Оценка реакции проводится по схеме Положительная реакция - утолщение кожной складки против физиологической нормы 0,5 и более см. Сомнительная реакция - утолщение кожной складки против физиологической нормы менее 0,5 см. Отрицательная реакция - отсутствие каких-либо признаков на введение аллергена. Полученные данные отражены в таблице. Как видно из таблицы, при аллергическом исследованием крупного и мелкого рогатого скота,верблюдов находящиеся в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, а также иммунизированные гетерологической вакциной получены отрицательные результаты, что свидетельствуют о специфичности аллергена. При исследовании животных разных видов из неблагополучного по бруцеллезу хозяйств предлагаемым аллергеном на 3 положительных результатов получено больше, чем противопоставленным аллергеном. Сомнительных результатов с предлагаемым аллергеном не было, тогда как с известным аллергеном они отмечены у 3 животных. Эти данные свидетельствуют о специфичности и большей чувствительности предлагаемого аллергена. Использование предлагаемого аллергена позволит быстро и эффективно выявить зараженных бруцеллезом животных, тем самым ускорить сроки оздоровления неблагополучных по бруцеллезу хозяйств. 19907 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ изготовления аллергена для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных,включающий выращивание культуры бруцелл на твердой питательной среде,их смыв,центрифугирование и ресуспендирование осадка,отличающийся тем, что в качестве антигена используют штамм 19, содержащий в своем составе -форму бруцелл, который доводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 100 млрд. микробных клеток в 1,0 мл,затем ее центрифугируют при 5000 об/мин в течение 40 мин, осадок удаляют, а надосадок сливают в стерильную посуду и автоклавируют при 1 атм в течение 30 мин и оставляют при комнатной температуре на 2-3 сут, затем фильтруют через стерилизующие пластины после чего, полученный фильтрат разводят в 10 раз 0,85 физиологическим раствором, добавляют формалин до объема 0,2 и получают целевой продукт.