Рекомбинантный штамм вируса гриппа А/НК/Otar/6:2/2010 (H3N8) для разработки живой гриппозной интраназальной вакцины для лошадей

(51) 61 31/00 (2006.01) 61 33/00(2006.01) 61 35/00(2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ аттенуации с последующей селекцией в присутствии антисывороток к вирусу / /1/68/162/35(38) и его пассажные варианты проявили высокую генетическую стабильность набора кодирующих мутаций, присущего донору аттенуации //1/68/162/35 (32). Полученный штамм обладает высокой репродуктивной активностью в куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32 С,характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью. Реассортант унаследовал два гена, кодирующих поверхностные белки (гемагглютинин и нейраминидазу) от эпидемического вируса и шесть генов, кодирующих негликозилированные белки от донора аттенуации. Штамм соответствует по антигенным свойствам вирусу///764/07 (38) в Т ГА титр составлял 1640, при взаимодействии с антисывороткой к вирусу(ризность в показателях инфекционной активности при 32 С и 40 С составляет 7 ЭИД 50/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при 32 С и 26 С составляет 4 ЭИД 50/0,2 мл). Методом рестрикционного анализа ДНК копий генов родительских штаммов и реассортанта установлено,что вакцинный штамм А///62/2010(38) унаследовал 6 внутренних генов от холодоадаптированного штамма / /1/68/162/35 (32), и 2 гена,кодирующих гемагглютинин и нейраминидазу, от эпизоотического штамма ///764/07 (38). Таким образом, представленный вакцинный штамм(38) характеризуется сочетанием полезших признаков, необходимых для приготовления живых гриппозных вакцин антигенной специфичностью поверхностных белков эпизоотического вируса ///764/07 (38),структурой генома. оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочуствительностью и холодоадаптированностью.(72) Червякова Ольга ВикторовнаСандыбаев Нурлан ТамамбаевичСултанкулова Куляйсан ТурлыбаевнаСтрочков Виталий Михайлович Табынов Кайсар КазыбаевичКыдырбаев Жайлаубай КыдырбаевичТайлакова Эльмира ТалгатовнаСансызбай Абылай Рысбайулы Киселев Олег ИвановичЦыбалова Людмила Марковна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/НК//62/2010 (38) ДЛЯ РАЗРАБОТКИ ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ЛОШАДЕЙ///62/2010 (38) - реассортант, полученный путем скрещивания эпизоотического вируса гриппа лошадей(38) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом гриппа - донором аттенуации, //1/68/162/35 (32). может быть использован в ветеринарии для профилактики гриппа лошадей живой интраназальной гриппозной вакциной. Рекомбинантный штамм вируса гриппа(38) получен методом генетической реассортации эпизоотического актуального штамма вируса гриппа(38) реассортант,полученный путем скрещивания эпизоотического вируса гриппа лошадей ///764/07 (38) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом гриппа - донором аттенуации,/ /1/68/162/35 (32), может быть использован в ветеринарии для профилактики гриппа лошадей живой интраназальной гриппозной вакциной. Вирус гриппа лошадей является одним из основных возбудителей респираторных инфекций лошадей, начиная с 1956 года. Вирус гриппа лошадей представлен двумя субтипами субтип 1,прототипом которого является ///1/56(38). Со времени выделения первоначальных изолятов появились новые антигенные варианты вируса, отличающиеся от прототипов. В настоящее время преобладающим субтипом является субтип 2. который в конце 80-х годов разделился на два семейства, представленных Европейскими и Североамериканскими изолятами. Для профилактики гриппа лошадей применяют убитые и живые вакцины. Убитые вакцины включают инактивированные цельновирионные. белковые субъединичные и ДНК-вакцины. Живые вакцины содержат аттенуированный вирус или живую векторную вакцину на основе вируса осповакцины. Существенный недостаток инактивированных вакцин,как цельновирионных,так и субъединичных, заключается в том что, они формируют у привитых животных исключительно гуморальный иммунитет, обладающий низкими возможностями перекрестной защиты от гетерогенных или генетически отдаленных полевых вирусов. Еще более значимым недостатком инактивированных вакцин является их низкая иммуногенность и продолжительность создаваемого ими иммунитета, что вынуждает производителей включать в состав вакцин дорогостоящие адъюванты и увеличивать кратность иммунизации животных, что неминуемо ведет к возрастанию стоимости профилактических средств. Кроме того,некоторые инактивированные вакцины с масляными адъювантами обладают высокой реактогенностью,вызывая воспалительные реакции на месте введения препарата у привитых животных. Иммунизация живым ослабленным вирусом гриппа точно имитирует естественную инфекцию. Антигены представлены иммунной системе, как через экзогенный, гак и эндогенный путь, и вакцина,таким образом, стимулирует иммунный ответ,аналогичный индуцированному инфекцией. Среди разработанных живых аттенуированных вакцин особое место занимают препараты,приготовленные на основе температурочувствительных или холодоадаптированных штаммов. Репликативные возможности холодоадаптированных штаммов (Т) при высоких(100 и более кратно) по сравнению с низкими температурами (34 С). В естественных условияхштаммы вируса гриппа лошадей эффективно репродуцируются в верхних дыхательных путях, где они вызывают местные и системные иммунные ответы. Наиболее значимое преимущество этого штамма заключается в том, что он неспособен размножаться при высоких температурах нижних дыхательных путей, где репликация дикого вируса обычно сопровождается развитием бронхита,пневмонии и отека легких. Указанное свойство этого штамма рассматривается экспертами как ключевой фактор, исключающий генерализацию инфекционного процесса, ввиду невозможности репликации вируса при нормальной температуре тела лошадей - .,-38/. -, , . - 2001. - .1219. - . 961-964 Экспериментально получены холодоадаптированные штаммы вируса гриппа лошадей,обладающие способностью размножаться при низкой температуре, не размножающиеся при повышенной температуре,доминантно интерферирующие с дикими штаммами вируса гриппа лошадей и аттенунрованные для лошадей. Холодоадаптированные реассортанты мастерштамма с дикими штаммами вируса гриппа лошадей должны содержать в геноме, по крайней мере, один сегмент генома мастер-штамма. Полученные штаммы можно применять как для профилактики гриппа лошадей, так и для лечения. Учитывая изменчивость возбудителя гриппа,вакцинные штаммы приходится заменять в период появления новых возбудителей гриппа. Известен также холодоадаптированный вакцинный вирус гриппа лошадей АТСС 2625. Вирус получили путем пассирования в куриных эмбрионах дикого вируса ///1/91(Н 38) при температуре 34, 30, 28, 26 С. Вакцинный вирус размножался в куриных эмбрионах при 26 С и в клеткахпри 34 С,но не при 39,5 С., - , ,,..200162(8) 1290-1294. Данный штамм вируса гриппа относится к семейству Североамериканских изолятов. Штаммы,аттенуированные длительным пассированием, как правило, не отличаются по биологическим свойствам от исходных эпидемических вирусов, что затрудняет отбор аттенуированных вариантов. Наиболее близким к заявленном изобретению является холодоадаптированный штамм вируса гриппа 8 В 1 ( -маркер связан с геном РА),полученный путем генетической реассортации вируса гриппа человека ( -маркер связан с генами РА и ) с диким типом вируса гриппа лошадей///16/74 (77). Использование вируса 8 В 1 для интраназальной вакцинации пони частично или полностью защищало животных от клинических 2 проявлений заболевания. Выделяемый животными вирус сохранял - фенотип.,, ,,,.- - 1., .. .. ,1988. . 88-93. Недостатки прототип 1) Вирус гриппа лошадей подтипа Н 77 утратил антигенную актуальность и вследствие этого не сможет вызвать защитную реакцию во время эпидемии гриппа, вызванной подтипом 38,аналогичным вирусу гриппа лошадей///764/07 (Н 38) 2) Рекомбинантный штамм содержит только 2 гена от донора аттенуации, что увеличивает вероятность реверсии фенотипа к дикому типу. Задачей данного изобретения является получение рекомбинантного вакцинного штамма вируса гриппа актуальной антигенной разновидности на основе эпизотического штамма вируса гриппа лошадей ///764/07(38). Сущность изобретения рекомбинантный штамм вируса гриппа ///62/2010 (Н 38) получен методом генетической реассортации эпизоотического актуального штамма вируса гриппа(32). Штамм / /1/68/162/35 (32) представляет собой универсальный донор и предназначен для получения высоко репродуктивных холодоадаптированных реассортантных штаммов вирусов гриппа для живых и инактивированных вакцин. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов под номером ГКВ 2442. Рекомбинантный штамм///62/2010 (38) и его пассажные варианты проявили высокую генетическую стабильность набора кодирующих мутаций,присущего донору аттенуации/1/68/162/35 (32). Полученный штамм обладает высокой репродуктивной активностью в куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32 С,характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью. Реассортант унаследовал два гена, кодирующих поверхностные белки(гемагглютинин и нейраминидазу) от эпидемического вируса и шесть генов, кодирующих негликозилированные белки от донора аттенуации. Штамм соответствует по антигенным свойствам вирусу ///764/07(38). Техническим результатом заявленного изобретения является создание рекомбинантного штамма вируса гриппа, характеризующегося холодоадаптированным температурочувствительным фенотипом, способного хорошо размножаться в куриных эмбрионах. При использовании полученного штамма возможно разработка аттенуированной живой гриппозной интраназальной вакцины для лошадей. Примеры получения рекомбинантного штамма вируса гриппа. Пример 1. Генетическая реассортация штаммов вируса гриппа. При заражении куриных эмбрионов эпизоотическим вирусом гриппа лошадей///764/07 (38) титры при 32 С составляли 256-512 ГАЕ/мл и 106,0 -106,5 ЭИД 50/ 0,2 мл. титры при 40 С составляли 64-128 ГАЕ/мл и 103,5-104,0 ЭИД 50/0,2 мл, при 26 С вирус не размножался, т.е. обладал - ифенотипом. При заражении куриных эмбрионов холодоадаптированным вирусом гриппа //1/68/162/35 (32) - донором аттенуации. титры при 26 С составляли 128-256 ГАЕ/мл и 105,0 105,5 ЭИД 50/0,2 мл., титры при 32 С составляли 1024-2048 ГАЕ/мл и 109,0-109,5 ЭИД 50/0,2 мл, титры при 40 С составляли 2-4 ГАЕ/мл и 101,0 ЭИД 50/0,2 мл, т.е. обладал са и - фенотипом. Для проведения генетической реассортации в 1011-дневные куриные эмбрионы вносили 107,0 ЭИД 50 эпизоотического штамма(38), облученного УФ (инфекционный титр в результате облучения снижался на 5.0-5.5 ЭИД 50) и холодоадаптированный донор аттенуации //1/68/162/35 (32) также в дозе 107,0 ЭИД 50. Инфицированные эмбрионы инкубировали при 32 С в течение 24 час. Затем собирали вируссодержащую аллантоисную жидкость из эмбрионов и проводили еще 2 пассажа в куриных эмбрионах при 26 С в присутствии антисыворотки к вирусу / / 1/68/162/35(32). На последнем этапе индивидуальные клоны выделяли методом предельных разведений в куриных эмбрионах в присутствии антисыворотки к вирусу //1/68/162/35 (32) при 32 С. Отобранные клоны исследовали в РТГА. Клоны 28/2 и 28/3 при взаимодействии с антисывороткой к вирусу-фенотипа реассортантов при температурах 26 С, 32 С, 40 С. 5,0 Клон 28/3 имел инфекционный титр при 26 С 10 ЭИД 50/0.2 мл. при 32 С 109,0 ЭИД 50/0,2 мл, при 40 С 101,5 ЭИД 50/0,2 мл, т.е. обладали фенотипом, характерным для донора аттенуации. Пример 3. Анализ генома ПЦР-рестрикционным методом. Методом рестрикционного анализа ДНК копий генов родительских штаммов и реассортантного клона 28/3 выявлено наличие 6 внутренних генов от холодоадаптированного штамма / /1/68/162/35 (32), и 2 генов,кодирующих гемагглютинин и нейраминидазу, от эпизоотического штамма(38). Пример 4. Изучение иммуногенных свойств проводили на морских свинках. Здоровые и серонегативные к вирусу гриппа морские свинки 3 были вакцинированы интраназально в объеме 100 мкл в каждый носовой ход (всего 200 мкл) реассортантным клоном 28/3. На 14 и 21 сутки после вакцинирования у животных опытной и контрольной групп отбирали образцы крови для исследования в РТГА. Среднегеометрический титр антител через 14 суток составил 119,1, на 21 сутки 1121,3. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Рекомбинантный штамм А/НК/О/62/2010(38) вируса гриппа лошадей семействародатипа А,депонированный в Коллекции микроорганизмов РГП НИИПББ КН МОН РК-04-12/, для разработки живой гриппозной интраназальной вакцины для лошадей.