Рекомбинантный штамм A/HK/Astana/6:2/2010 M-06-10/D вируса гриппа на основе классической генетики, предназначенный для производства диагностических и вакцинных препаратов против гриппа A/H5N1

(51) 12 7/00 (2011.01) 61 39/145 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Изобретение предназначено для получения диагностических и вакцинных препаратов против гриппа /51. Рекомбинантный вакцинный штамм///62/2010 М-06- 10/ - реассортант. Он получен путем скрещивания эпидемически актуального вируса //62/2009 вируса гриппа/51 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом донором аттенуации А/Гонконг/1/68/162/35(32). Штамм-06-10/ активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32 С, характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью. Реассортант унаследовал от эпидемического вируса два гена, кодирующих поверхностные белки(гемагглютинин и нейраминидазу) и шесть генов, кодирующих негликозилированные белки от донора аттенуации. Штамм соответствует по антигенным свойствам штамму вируса //62/2009 вируса гриппа/51. Результаты секвенирования подтвердили, что рекомбинантный штамм в составе генома имеет гены НА иот штамма А/Астана/62/2009 (51) и внутренние гены (РВ 2, РВ 1, РА, ,и М) от холодадаптированного штамма/Гонконг//68/162/35(32). Таким образом, на основе классической генетики конструирован реассортантный рекомбинантный штамм ///62/2010 вируса гриппа /51 с антигенной формулой генома 62, имеющий в составе шесть внутренних генов от холодадаптированного штамма-донора А/Гонконг/1/68/162/35 (32) и два поверхностных генов от штамма //62/2009 эпидемически актуального вируса гриппа /51. Рекомбинантный штамм ///62/2010 вируса гриппа/51 проявляет свойства температурочувствительности, Холодовой адаптации и аттенуации необходимые для вакцинных штаммов для ЖГВ.(72) Султанкулова Куляйсан ТурлыбаевнаСандыбаев Нурлан ТамамбаевичСансызбай Абылай РысбайлыЧервякова Ольга ВикторовнаСтрочков Виталий Михайлович Кисилев Олег ИвановичЦыбалова Людмила Марковна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан-06-10/ ВИРУСА ГРИППА НА ОСНОВЕ КЛАССИЧЕСКОЙ ГЕНЕТИКИ,ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ГРИППА /51(57) На основе классической генетики сконструирован рекомбинантный штамм/(51), предназначенный для производства диагностических и вакцинных препаратов против гриппа/51,наиболее близкий к репрезентативным штаммам клайда 2.2,рекомендованных ВОЗ для производства противогриппозных вакцин. Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии, и представляет собой новый актуальный рекомбинантный штамм вируса гриппа, прошедший 5 пассаж в развивающиеся куриных эмбрионах (РКЭ). Инфекционная активность вируса на 10-11-сут РКЭ составляет 8,0-8,5 ЭИД 50/см 3. Гемагглютинирующая активность 1512 11024. Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии, и представляет собой сконструированный на основе классической генетики новый актуальный рекомбинантный штамм/51,используемый для производства диагностических и вакцинных препаратов против гриппа /51. Рекомбинантный штамм ///62/2010 вируса гриппа /51 получен методом генетической реассортации эпидемически актуального вируса//62/2009 вируса гриппа /51 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом донором аттенуации/ /62/2009 вируса гриппа /(51), был получен из высокопатогенного штамма///6/05 с антигенной формулой (51),выделенный в Республике Казахстан в 2005 году и штамма донора //8/34. Филогенетический анализ гемагглютинина и нейраминидазы штамма(51) показал его принадлежность к клайду 2.2, представители которого рекомендованы ВОЗ при отборе кандидатов для разработки вакцины против гриппа /(51). Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение,является получение вакцинного штамма актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса- Вакцинный штамм А/17/Техас/91/1/3 (11) прототип 1 (Патент РФ 2 084 524 от 20.07.97. Опубликован в бюллетене изобретений 20 от 20.07.1997 г.) Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Калифорния/04/6 (32) и донор аттенуиции А/Ленинград/134/17/К 7/57 (22) для его получения прототип 2 (Патент РФ 2 315 101 С 2. от 20.07.2007 г) Прототипы 1 и 2 имели антигенную формулу 11 и 32 соответственно, и утратили антигенную актуальность и вследствие этого не смогут вызвать защитную реакцию во время эпидемии гриппа,вызванной штаммом, аналогичным вирусу гриппа с антигенной формулой 51. Целью настоящего изобретения являлось конструирование нового актуального рекомбинантного штамма вируса гриппа, наиболее близкого к репрезентативным штаммам клайда 2.2,рекомендованных ВОЗ для производства диагностических и вакцинных препаратов против вируса гриппа /51, обладающего низкой вирулентностью и высокой репродуктивной активностью в системе культивирования. Предлагаемое изобретение включает рекомбинантный штамм, совокупность существенных признаков которого,обеспечивает получение следующих технических результатов. Технический результат Техническим результатом предлагаемого изобретения является конструирование рекомбинантного вакцинного штамма/51 на основе классической генетики,предназначенный для производства диагностических и вакцинных препаратов против гриппа /51. Сущность изобретения Изобретение предназначено для получения диагностических и вакцинных препаратов против гриппа /51. Рекомбинантный вакцинный штамм///62/2010 М-06- 10/ - реассортант. Он получен путем скрещивания эпидемически актуального вируса //62/2009 вируса гриппа/51 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом донором аттенуации А/Гонконг/1/68/162/35(Н 32). Штамм-06-10/ активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32 С, характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью. Реассортант унаследовал от эпидемического вируса два гена, кодирующих поверхностные белки(гемагглютинин и нейраминидазу) и шесть генов, кодирующих негликозилированные белки от донора аттенуации. Штамм соответствует по антигенным свойствам штамму вируса //62/2009 вируса гриппа/51. Рекомбинантный штамм А/НК//62/2 010 получен методом генетической реассортации эпидемически актуального вируса//62/2009 вируса гриппа /51 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом донором аттенуации А/Гонконг/1/68/162/35(Н 32) с последующей селекцией в присутствии антисыворотки к вирусу А/Гонконг/1/68/162/35(Н 32). Донор аттенуации холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа А/Гонконг/1/68/162/35(Н 32),для получения безвредных живых гриппозных вакцин. Родительский штамм А/ /62/2009 вируса гриппа /(51), был получен из высокопатогенного штамма ///6/05 с антигенной формулой//8/34(11). Филогенетический анализ гемагглютинина и нейраминидазы штамма ///6/05 (51) показал его принадлежность к клайду 2.2,представители которого рекомендованы ВОЗ при отборе кандидатов для разработки вакцины против гриппа /(51). Последовательность,кодирующая НА высокопатогенного штамма ///6/05(51), была модифицирована за счет удаления участка,кодирующего мотив повторяющихся основных аминокислотв сайте расщепления НА. Кроме того, для предотвращения возможности восстановления мотива повторяющихся основных аминокислот за счет соскальзывания полимеразы,были введены замены Т и КТ. Е В результате, мотив повторяющихся основных аминокислот высокопатогенного штамма///6/05 (51) был заменен на последовательность /, которая характерна для низкопатогенных штаммов Н 5 вируса гриппа. Секвенирование и последующий филогенетический анализ последовательности гена,кодирующего НА рекомбинантного вируса//62/2009,подтвердили наличие модификации в сайте расщепления гена гемагглютинина. В связи с этим штамм//62/2009 (51) был выбран в качестве донора поверхностных белков гемагглютинина и нейраминидазы для получения рекомбинантного штамма на основе классической генетики. В качестве донора внутренних белков использовали холодоадаптированный штамм- донор А/Гонконг/1/68/162/35 (32), разработанный в НИИ гриппа СЗО РАМН (РФ). Штамм создан на основе эпидемического вируса А/Гонконг/1/68, выделенного от больного человека в Гонконге, и переданный в НИИ гриппа из Национального института биологического контроля и стандартов (Лондон, Англия) в 1969 г. Аттенуированный штамм А/Гонконг/1/68/162/35(32) представляет собой универсальный донор и предназначен для получения высоко репродуктивных холодоадаптированных реассортантных штаммов вирусов гриппа для живых и инактивированных вакцин. Принципиальная схема получения реассортанта///62/2010 -06-10/ предусматривает смешивание родительских пар эпидемиологически актуального штамма //62/2009 (51) и штамм-донора аттенуации А/Гонконг/1/68/162/35(32) с последующими селективными пассажами в присутствии сыворотки к штамму-донору аттенуации и клонированием. Реассортацию проводят в куриных эмбрионах при оптимальной и пониженной температурах инкубации. Приготовление высокорепродуктивных штаммов вируса гриппа предполагает следующие этапы работы 1. Приготовление иммунной кроличьей сыворотки к донору аттенуации А/Гонконг/1/68/162/35 (32). Приготовление иммунных сывороток к эпидемиологически актуальному штамму//62/2009 (51) с использованием антигена, полученного в куриных эмбрионах и культуре клеток. 2. Характеристика родительских штаммов и накопление в куриных эмбрионах донорского штамма и эпидемического вируса для последующей рекомбинации в куриных эмбрионах. 3. Рекомбинация в куриных эмбрионах эпидемического вируса с донорским штаммом в различных соотношениях. Возможна предварительная обработка эпидемического штамма ультрафиолетом или температурой. С помощью реакции торможения гемагглютинирующей активности (РТГА) отбирается вирусная популяция, содержащая в своем составе как донорский, так и родительский штаммы вируса. 4. Двух-трехкратная иммуноселекция отобранной рекомбинантной смеси в куриных эмбрионах в присутствии иммунной сыворотки к донорскому штамму с целью обогащения популяции рекомбинантами с актуальной антигенной структурой. На каждом этапе иммуноселекции определяется гемагглютинирующая активность вирусной популяции в РГА, а ее антигенный составв обратной реакции(ОРТГА) с иммунными сыворотками к донорскому и эпидемическому штаммам. При использовании в качестве донора холодоадаптированных штаммов вируса гриппа селекцию проводят также при пониженной температуре культивирования. 5. Клонирование однородных по антигенной структуре гемагглютинина вирусной популяции на куриных эмбрионах методом предельных разведений(10-7-10-9) в присутствии иммунной сыворотки к донорскому штамму, взятой в разведении 110 - 1100. 6. Изучение инфекционной и гемагглютинирующей активности, а также структуры генома полученных клонов. 7. Дополнительная 2-кратная расчистка 3-6 наиболее перспективных клонов на куриных эмбрионах методом предельных разведений (10-7-10-9). 8. Изучение генетической стабильности отобранных рекомбинантов путем 5- кратного пассирования на куриных эмбрионах при использовании максимальных заражающих доз вируса. 9. Лиофилизация вакцинного штамма///62/2010 -06-10/, определение их инфекционной и гемагглютинирующей активности. 10. Лабораторный контроль лиофилизированных штаммов по показателям бактериологической стерильности, безвредности, отсутствию посторонних агентов, специфичности, генетической стабильности. Контроль стерильности Контроль стерильности проводят методом прямого посева с использованием тиогликолевой питательной среды. В 20 бактериологических пробирк,содержащих по 10,0 мл тиогликолевой среды, вносят по 1,0 мл исследуемого материала. Посевы инкубируют при температуре 32-33 С для выявления аэробных и анаэробных бактерий и при температуре 22-23 С для выявления грибов и бактерий с оптимумом роста в данном температурном режиме. Наблюдение проводят в течение 14 дней. Наличие роста микроорганизмов оценивается визуально по выявлению мутности, осадка, хлопьев и других микроскопических изменений. Контроль контаминации микоплазмами Выявление контаминации осуществляют посевом на селективную питательную среду для выращивания микоплазм. Перед употреблением среду разогревают в водяной бане до полного расплавления агара,добавляют 15 сыворотки крови лошади и 100 ед./мл пенициллина и разливают по 10 мл в бактериологические пробирки. В пробирки вносят испытуемый материал методом укола по всему объму(по 0,5 мл в каждую пробирку). Срок инкубации 14 суток при 37. В качестве контроля используют стандартную культуру, отсутствие признаков роста в испытуемых образцах при росте в контрольной культуре свидетельствует об отсутствии контаминации микоплазмами в тестируемом материале. Контроль на постороннюю вирусную контаминацию Контроль в клеточных культурах 3 Испытуемый материал смешивают с иммунной сывороткой, взятой в количестве, достаточном для полной нейтрализации содержащегося в пробе вируса. Для получения иммунных сывороток используют животных, ткани которых не применяют для приготовления клеточных культур. Смесь выдерживают при заданной температуре в течение необходимого для нейтрализации данного вируса времени, после чего вносят в матрасы с тремя видами культур клеток. Для каждого вида культуры клеток оставляют один контрольный незараженный флакон. Культуры выдерживают при температуре (361)С 14 сут. со сменой среды на 4-6 сут., просматривая под микроскопом на наличие цитопатических изменений. По истечении 14 сут. опытные и контрольные клеточные культуры замораживают, оттаивают и производят пассаж на одноименной культуре. Разведение вносимого материала поддерживающей средой не должно превышать 14. Культуры клеток(опытную и контрольную) выдерживают при температуре (361)С 14 сут. со сменой среды на 4-6 сут., просматривая под микроскопом на наличие цитопатических изменений. По истечении срока наблюдения культуры проверяют в реакции гемадсорбции. Для этого культуральную жидкость сливают, клеточный монослой отмывают раствором Хенкса или 0,85-ным раствором натрия хлорида,имеющим температуру 20-25 С, и в матрасы с культурой вносят 0,25-ную взвесь эритроцитов морской свинки в 0,85-ном растворе натрия хлорида в объеме, достаточном для того, чтобы покрыть весь клеточный монослой. После инкубации в течение 30 мин. при температуре (41)С и последующей инкубации 30 мин. при 20-25 С взвесь эритроцитов сливают, клеточный монослой трижды отмывают раствором Хенкса или 0,85-ным раствором натрия хлорида, имеющим температуру 20-25 С, и просматривают под микроскопом на наличие гемадсорбции (увеличение 70 Х). Контроль на куриных эмбрионах В случае если содержащийся в контролируемом материале вирус патогенен для куриных эмбрионов,его необходимо предварительно нейтрализовать иммунной сывороткой. Испытуемый материал вводят трем группам куриных эмбрионов по 10 штук в каждой группе. Первой группе куриных эмбрионов 9 - 10-дневного возраста материал вводят по 0,25 мл в аллантоисную полость. Эмбрионы инкубируют при температуре(361)С 5-6 сут. По истечении указанного срока аллантоисную жидкость проверяют в реакции гемагглютинации с эритроцитами морской свинки и петуха. При этом в лунках агглютинационных досок готовят 5-6 последовательных двукратных разведений(на 0,85-ном растворе натрия хлорида) аллантоисной жидкости из каждого инокулированного эмбриона. Затем в лунки добавляют равные объемы 0,5 суспензии (на 0,85-ном растворе натрия хлорида) эритроцитов. После 30 - 40 мин. выдерживания при температуре 20-25 С учитывают результаты. Материал считают прошедшим контроль, если в течение указанного срока инкубации остаются 4 живыми не менее 80 инокулированных эмбрионов и при отрицательной реакции гемагглютинации во всех случаях. Второй группе куриных эмбрионов 7 - 8-дневного возраста материал вводят по 0,25 мл в желточный мешок. Эмбрионы выдерживают при температуре(371)С 10 сут. Материал считается прошедшим контроль, если к концу указанного срока инкубации остаются живыми не менее 80 инокулированных эмбрионов. Третьей группе куриных эмбрионов 10 - 11 дневного возраста материал вводят по 0,2 мл на хорионаллантоисную оболочку с боковой поверхности яйца через искусственную воздушную полость или со стороны естественного воздушного мешка. Эмбрионы инкубируют при (371)С в течение 5-6 сут. По истечении указанного срока оболочки извлекают и просматривают. Материал считается прошедшим контроль, если к концу указанного срока инкубации остаются живыми не менее 80 инокулированных эмбрионов и на хорионаллантоисных оболочках всех эмбрионов отсутствуют изменения,видимые невооруженным взглядом. Генетическая стабильность Испытуемые штаммы в разведении 110 пассируются 5 раз в системе куриных эмбрионов. Изучается стабильность основных биологических свойств штаммов взятых до и после пассирования(антигенная структура, гемагглютинирующая и инфекционная активность, структура генома). Токсичность Испытание проводят на двух видах животных белых мышах обоего пола, массой 18 - 20 г, и морских свинках обоего пола, массой 250 - 350 г. В исследованиях должны быть использованы здоровые животные,содержащиеся в соответствии с действующими правилами, на которых ранее не проводили какие- либо испытания. Массу животных определяют в день начала испытания. Мышам препарат вводят внутрибрюшинно 5-ти животным в дозе не более 1 мл. Морским свинкам препарат вводят подкожно в дозе не более 10 мл. Препараты вводят стерильным шприцем, погрешность измерения которого не должна превышать 4. Наблюдение за животными осуществляют ежедневно в течение 7 сут. Препарат считают выдержавшим испытание, если- в течение периода наблюдения все животные остались живы и ни у одного из них не были выявлены видимые признаки заболевания- масса каждого животного в день окончания наблюдения не уменьшилась по сравнению с исходной- ни у одной морской свинки, получившей препарат подкожно, не развился некроз или абсцесс в месте введения. Рекомбинантный штамм ///62/2010 вируса гриппа/51 проявил высокую генетическую стабильность набора кодирующих мутаций,присущего донору аттенуации А/Гонконг/1/68/162/35(32). Рекомбинантный штамм ///62/2010 (51) на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Гонконг/1/68/162/35 (32) устойчиво проявляет 26389 и са- фенотип, то есть свойства, характерные для холодадаптированного донора аттенуации. Методом рестрикционного анализа ДНК копий генов вакцинного и родительских штаммов установлено,что вакцинный штамм///62/2010 унаследовал 6 генов,кодирующих внутренние белки (РВ 1, РВ 2, РА, , М,) от донора аттенуации А/Гонконг/1/68/162/35(Н 32) и 2 гена, кодирующих поверхностные белки - НА (гемагглютинин) и(нейраминидазу) - от эпидемически актуального штамма //62/2009. Гемагглютинин в РТГА идентичен вирусу//62/2009,антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. Штамм является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при 32 С и 39 С составляет 6.0 ЭИД 50/мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при 32 С и 26 С - 2.0 ЭИД 50/мл). Таким образом,представленный вакцинный штамм///62/2010 характеризуется специфичностью поверхностных белков эпидемического вируса вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации. Морфология штамма - полиморфная,типичная для вируса гриппа. Выделенный штамм ///62/2010 вируса гриппа птиц депонирован в Коллекции микроорганизмов Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан (РГП НИИПББ КН МОН РК) с регистрационным номером-06-10/. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Рекомбинантный штамм ///62/2010 вируса гриппа /51 семействародатипа А, депонированный в Коллекции микроорганизмов РГП НИИПББ КН МОН РК под номером -06-10/, применяемый в биотехнологии для производства диагностических и вакцинных препаратов против гриппа /51.