Способ молекулярно-генетической идентификации ДНК микобактерий туберкулеза полимеразно-цепной реакцией

(51) 12 15/10 (2011.01) 12 1/68 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ обработку проб цельной крови для лизиса эритроцитов крови раствором, получение осадка пробы крови, освобождение осадка от гемоглобина с помощью лизирующего буферного раствора, и промывания осадок ценртифугированием, его высушивание с последующим ресуспендированием осадка,с последующей идентификацией полученной ДНК на наличие ДНК микобактерии туберкулеза, при этом лизис эритроцитов пробы цельной крови проводят 3,5 раствором цитрата натрия, освобождение осадка пробы крови от гемоглобина осуществляют путем последовательного добавления лизирующих буферов 1 мМ Трис НС 1 и 1 мМ ЭДТА и 1 тритон при 8,0, дополнительно осадок пробы крови прогревают при 95 С в течение 15 мин и добавляют в него охлажденный 70 раствор этанола, после чего осадок промывают ценртифугированием,высушивают, ресуспендируют, полученную в пробе ДНК идентифицируют на наличие ДНК микобактерии туберкулеза. Разработанный способ диагностики туберкулеза прост в исполнении,дешевле импортных тест-систем и отличается достаточной чувствительностью.(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Казахский национальный медицинский университет им. С.Д.Асфендиярова Министерства здравоохранения Республики Казахстан(54) СПОСОБ МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ДНК МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА ПОЛИМЕРАЗНО-ЦЕПНОЙ РЕАКЦИЕЙ(57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике с целью проведения молекулярногенетической идентификции ДНК микобактерии туберкулеза с помощью полимеразно-цепной реакции. Способ молекулярно-генетической идентификации ДНК микобактерии туберкулеза полимеразно-цепной реакцией,включающий Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике с целью проведения молекулярногенетической идентификции ДНК микобактерии туберкулеза с помощью полимеразно-цепной реакции. Наиболее близким к заявляемому по технической сущности является способ молекулярно-генетической идентификции ДНК микобактерии туберкулеза полимеразно-цепной реакцией, включающий лизис эритроцитов путем обработки пробы цельной крови буферным раствором 2 /125 в сотношении 51, проведение освобождение осадка от гемоглобина путем добавления буферного раствора 10 мМ Триси 1 мМ ЭДТА ( 7,6) с 1 тритоном,с последующим промыванием осадка ценртифугированием, проведением заморозки сгустка пробы крови, который высушивают, ресуспендируют и полученную в пробе ДНК идентифицируют на наличие ДНК микобактерии туберкулеза ( ., .,.. // .. - 1986. - .132. - .541-551). Однако известный способ является недостаточно чувствительным. Задачей изобретения является разработка эффективного способ молекулярно генетической идентификации ДНК микобактерий туберкулеза с использованием полимеразной цепной реакции. Способ молекулярно-генетической идентификации ДНК микобактерии туберкулеза полимеразно-цепной реакцией, включающий обработку проб цельной крови для лизиса эритроцитов крови раствором, получение осадка пробы крови, освобождение осадка от гемоглобина с помощью лизирующего буферного раствора, и промывания осадок ценртифугированием,его высушивание с последующим ресуспендированием осадка,с последующей идентификацией полученной ДНК на наличие ДНК микобактерии туберкулеза, при этом лизис эритроцитов пробы цельной крови проводят 3,5 раствором цитрата натрия, освобождение осадка пробы крови от гемоглобина осуществляют путем последовательного добавления лизирующих буферов 1 мМ Трис НС 1 и 1 мМ ЭДТА и 1 тритон при 8,0,дополнительно осадок пробы крови прогревают при 95 С в течение 15 мин и добавляют в него охлажденный 70 раствор этанола, после чего осадок промывают ценртифугированием,высушивают,ресуспендируют, полученную в пробе ДНК идентифицируют на наличие ДНК микобактерии туберкулеза. Способ осуществляют следующим образом. 1. У пациента из вены берут пробу цельной крови три мл с 3,5 цитратом натрия для лизиса крови,отбирают плазму и центрифугируют при 10000 об/мин. 2. Для освобождения осадка от гемоглобина на 10 мин в осадок добавляют ТЕ буфер,6,8 (уже готовый, хранится в холодильнике). 3. Затем к осадку добавляют лизирующий буфер 1 мМ Трис НС 1, 1 мМ ЭДТА. 4. Затем добавляют 1 тритон 8,0 (готовый,хранится в холодильнике). 2 5. Осадок прогревают при 95 С в течение 15 мин. 6. Затем осуществляют центрифугирование осадка для отмывания в течение 15 минут при комнатной температуре на 12000 об/мин. 7. Сливают супернатант. 8. Добавляют в осадок 1 мл холодного 70 этанол и центрифугируют при 12000 об/мин, в течение 5 минут. Убирают остаточные СТАВ и , осторожно сливают супернатант. 9. Сушат осадок при комнатной температуре в течение 5 минут. 10. Затем осадок выводят из осадка в жидкость путем ресуспендирования в 20 мкл 0,1 ТЕ буфера. Полученную пробу ДНК хранят при 4 С, полученную пробу ДНК идентифицируют на наличие ДНК микобактерии туберкулеза. Очищенную ДНК, в количестве 3 мкг, обрабатывают рестриктазойН 1 и анализируют в 1 агарозном геле. Исследуемую последовательность ДНК изучаемого гена клонируют, используя полимеразно-цепную реакцию. Полученные ампликоны подвергают воздействию рестриктаз, которые подбирают с помощью специальных программ, с учетом того, что фрагменты, на которые разрезаются полученные ампликоны, выявляют на агарозном геле. Амплификацию проводят с использованием внешних праймеров, представляющих собой 53 и 53, с использованием температуры отжига для первого этапа 60 С, 20 циклов и температуры отжига для второго этапа 72 С, 25 циклов в ТРИС-НС буфере, с КС, формамидом и твином и продукты амплификации разделяют электрофорезом с выявлением под ультрафиолетовой лампой ярко-оранжевой полоски ДНК образца на уровне ярко-оранжевой полоски, это ДНКи. Проверку специфичности проводили на музейных штаммах ., М. . Для проведения анализа используют амплификатор - -5 и гель - докаментирующую систему - -2000. Клиничекий пример выполнения способа. В качестве примера своевременного выявления микобактерии приводим выписку из карты больного А., возраст -68 лет, поступил в НЦПТ борьбы с туберкулезом в мае 2008 г. Больным себя считает с детства. Число рецидивов заболевания - 5-6 раз в год. До обращения период обострения в течение 2 недель. Лечился в поликлинике по месту жительства, где проводилось лечение антибиотиками широкого спектра действия путем внутримышечных инъекций и промывание верхнечелюстных пазух раствором диоксидина. Однако улучшения состояния не наблюдалось. Предположительный диагноз инфильтративный туберкулез легких. У больного для уточнения постановки диагноза из вены взяли три мл цельной крови с 3,5 цитратом натрия. Для освобождения от гемоглобина на 10 мин в осадок добавили ТЕ буфер,6,8, затем также лизирующий буфер 1 мМ Трис НС 1, 1 мМ ЭДТА,добавили 1 тритон 8,0. Осадок прогрели при 95 С в течение 15 мин. Затем провели центрифугирование для отмывания осадка в течение 15 минут при комнатной температуре на 12000 об/мин, супернатант слили. После чего добавили в осадок 1 мл холодного 70 этанола и центрифугировали при 12000 об/мин, в течение 5 минут. Осадок просушили при комнатной температуре в течение 5 минут. Осадок ресуспендировали в 20 мкл 0.1 ТЕ буфера. Провели идентификацию полученной пробы ДНК на наличие ДНК микобактерии туберкулеза. Исследуемую последовательность ДНК изучаемого гена клонировали, используя полимеразно-цепную реакцию. При ультрафиолетовым освещении было определено в определенном месте ярко-оранжевую полоску, контрольный образец (когда вместо образца была внесена вода) не светился. Таким образом, у больного выявлена туберкулезная палочка, был поставлен диагноз туберкулез. Разработанным способом молекулярногенетической идентификации ДНК микобактерий туберкулеза с помощью полимеразной цепной реакции были исследованы 200 больных туберкулезом легких. Выявление ДНК микобактерий туберкулеза составило 80, при использовании известного способа в 60. Такая выявляемость (чувствительность) ДНК микобактерии туберкулеза при использовании разработанного способа была подтверждена при применении для диагноза туберкулезного комплекса на тест-системе. Разработанный способ диагностики туберкулеза прост в исполнении, дешевле импортных тест-систем и отличается достаточной чувствительностью. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ молекулярно-генетической идентификации ДНК микобактерии туберкулеза полимеразно-цепной реакцией, включающий обработку проб цельной крови для лизиса эритроцитов крови раствором, получение осадка пробы крови, освобождение осадка от гемоглобина с помощью лизирующего буферного раствора, промывани е осадка центрифугированием,его высушивание, ресуспендирование, с последующей идентификацией полученной ДНК на наличие ДНК микобактерии туберкулеза, отличающийся тем, что после освобождения осадка пробы крови от гемоглобина, его дополнительно прогревают при 95 С в течение 15 минут и добавляют в него охлажденный 70 раствор этанола.