Способ выделения ДНК из крови

(51) 12 1/68 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ отказа от использования в способе выделения ДНК дорогостоящих реагентов ферментов и труднодоступных материалов - центрифужных колонок. Способ осуществляют следующим образом выделяют ДНК из крови путем проведения лизиса цельной крови с добавлением гуанидина тиоцианата до концентрации 4 М, депротеинизацию путм добавления протеиназы К, адсорбцию ДНК из лизата на тврдую фазу, содержащую кремнезм,десорбцию ДНК с сорбента в буфер с низкой ионной силой. Вместо ферментативной депротеинизации протеиназой проводится лизис эритроцитов при сохранении целостности ДНКсодержащих клеток крови и затем удаление мембран эритроцитов, и вместо проточных колонок для улавливания ДНК из лизата применяется суспензионный сорбент. Конечным результатом является препарат геномной ДНК, выделенной из крови, с высокой чистотой (А 260/А 2801,7-1,9) и выходом (100 мкл раствора ДНК с концентрацией 10-50 нг/мкл из 300 мкл крови).(72) Евтыхова Елена Борисовна Бердыгулова Жанна Амировна Хасенов Бекболат Бауржанович Шустов Александр Вячеславович Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ КРОВИ(57) Изобретение относится к способам выделения ДНК и может быть использовано в молекулярной диагностике, генетической идентификации. Задачей изобретения является разработка способа выделения геномной ДНК из цельной крови. Технический результат изобретения - снижение себестоимости процедуры выделения ДНК и большая доступность для лабораторий развивающихся стран за счт Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к способам выделения ДНК и может быть использовано в молекулярной диагностике генетических или инфекционных заболеваний, в генетической идентификации людей и животных и в научных исследованиях. Анализ нуклеиновых кислот с целью обнаружения диагностически значимых последовательностей приобрл исключительно важное значение в медицине и ветеринарии. Специалистам известны наборы химических реактивов для выделения ДНК, которые выпускают широко известные производители ( ,и др.). Однако компаниипроизводители не раскрывают своих ноу-хау с учтом немалой цены коммерческих наборов для выделения ДНК, это создат экономическое давление на конечных пользователей таких наборов (медиков,ветеринаров и биологов), ощутимое в развивающихся странах. Необходимость развивать технологическую базу и уровень оснащнности организаций,занимающихся диагностикой и научными исследованиями, делает актуальными разработку новых способов выделения ДНК. Задачей изобретения является разработка способа выделения геномной ДНК из цельной крови. Техническим результатом заявляемого изобретения является снижение себестоимости процедуры выделения ДНК при сохранении чистоты и выхода ДНК и обеспечение большей доступности этого способа для лабораторий развивающихся стран. Способность ДНК к обратимой адсорбции на силикагеле представляет собой физико-химическую основу для способов выделения ДНК посредством адсорбции- элюции (это простейший вариант хроматографии). Наиболее общей технологической схемой является четырхшаговая процедура лизисадсорбция- отмывка- элюция. В природных материалах геномная ДНК не существует в свободном виде, но прочно, хотя и не ковалентным образом, связана с белками в сложный комплекс, называемый хроматином. Хроматин содержится в ядрах эукариотических клеток и большую часть времени прочно прикреплн к мембранам ядерного конверта. Таким образом, во всех способах выделения геномной ДНК первым шагом должно быть разрушение клеток и их ядер (т.е. лизис). Лизиса мембранных структур добиваются посредством обработки детергентами. Далее осуществляют диссоциацию хроматина, при которой необходимо обеспечить сохранение целостности освобожднных от белков протяжнных фрагментов ДНК. Для этого пробы, содержащие хроматин,обрабатывают протеолитическими ферментами или хаотропными агентами. Последние представляют собой химические вещества, которые разрушают макромолекулярные структуры высокого порядка(третичные структуры белков), солюбилизируют клеточные мембраны, но не денатурируют ДНК и РНК. Этап сорбции эксплуатирует природную способность ДНК адсорбироваться из раствора обратимым образом на поверхность кристаллических материалов с определнной периодической структурой 2 поверхности в присутствии хаотропных солей ((кремнезм, 2), мелкодисперсное стекло, кварц,диатомовая земля или цеолиты являются примерами таких материалов. Способность хаотропных солей облегчать селективную адсорбцию ДНК происходит по причине того, что в высоких концентрациях они снижают растворимость полярных соединений (например,нуклеиновых кислот), но повышают растворимость в воде неполярных веществ и макромолекул, имеющих гидрофобные участки (например, белков) (,.-. . .72, 1997 . 65-76). Среди хаотропных солей, присутствие которых в растворе способствует адсорбции ДНК на вышеперечисленные сорбенты, наибольший эффект продемонстрирован для следующих соединений гуанидина тиоцианат,гуанидина гидрохлорид , натрия перхлорат (4),иодид натрия или калия (, ) ( 7,491,495 В 2.,К.,Т., 17.02.2009, 12 1/682010/0021905 А 1/,.,28.01.2010, 12 1/68). В существенно меньшей степени данный эффект промотора адсорбции выражен у хлоридов и ацетатов натрия или калия. Отмывка сорбента, несущего адсорбированную на нм ДНК, заключается в ресуспендировании в буфере с ионной силой, пониженной по сравнению с условиями оптимальной адсорбции. Это приводит к диссоциации с сорбента контаминирующих примесей,способных лишь к неспецифическому связыванию с силикагелем(белки,гликопротеины крови). Присутствие в отмывочных буферах органических растворителей (этанол или изопропанол) удерживает ДНК в адсорбированном состоянии. Деадсорбция (элюция) ДНК с сорбента происходит на последней стадии протокола выделения в буфер с очень низкой ионной силой (10 мМ Трис-НС, 0,1 мМ ЭДТА) при нагревании (50-65 С). В патенте США 7491495 описан способ выделения ДНК из крови с добавлением лизирующего буфера, содержащего( 7,491,495 В 2..,К.,Т., 17.02.2009, 12 1/68). В этом способе для депротеинизации в смесь добавляют фермент протеиназу К. Лизат инкубируют 15 мин при температуре 56 С, затем переносят лизат в спин-колонкупроизводства, имеющую на дне фильтр с закреплнными на нм частицами силикагеля. Лизат центрифугируют через спин-колонку, при этом ДНК остатся адсорбированной на фильтре. Затем ДНК промывают буфером, содержащимв концентрации 5 М, и затем низкосолевым отмывочным буфером (20 мМ , 2 мМ Трис-НС, 80 этанол). Промытый фильтр высушивают, после чего элюируют ДНК в 300 мкл элюирующего буфера (50 мМ Трис 8.2). Результатом является выделенная геномная ДНК с показателем чистоты 260/2801.1-1.5. Изобретение, описанное в данной заявке, сходно с прототипом в том отношении, 26391 что растворв высокой концентрации (1- 5 М) применяется в качестве лизирующего агента и промотора адсорбции. Недостатками способа прототипа являются 1) применение в способе прототипа ферментативной обработки с помощью протеиназы К, что увеличивает себестоимость процедуры выделения 2) применение в способе прототипа центрифужных колонок (спин-колонок),что приводит к дополнительным экономическим расходам и делает невозможным использование способа прототипа в развивающихся странах, где спин-колонки коммерчески недоступны 3) невозможность замены спин-колонок на другие типы сорбента (суспензионные сорбенты) в способе прототипа. По результатам наших экспериментов,замена в способе прототипа спин-колонок на доступный и дешвый суспензионный сорбент(силика, 02) приводит к получению препаратов ДНК с низкой чистотой. Это объясняется неполнотой избавления от липидов крови и остаточных белков при отмывках сорбента буферами, используемыми в способе прототипа. В основу изобретения положена задача разработать способ получения препаратов геномной ДНК,выделенной из крови, техническим результатом которой является меньшая себестоимость и большая доступность для лабораторий развивающихся стран за счт отказа от использования в способе выделения ДНК дорогостоящих реагентов - ферментов и труднодоступных материалов - центрифужных колонок. Для достижения технического результата в известном способе выделения ДНК из крови проводят лизис цельной крови путм добавления гуанидина тиоцианата до концентрации 4 М, депротеинизацию путм добавления протеиназы К, адсорбцию ДНК из лизата на тврдую фазу, содержащую кремнезм,десорбцию ДНК с сорбента в буфер с низкой ионной силой. Вместо ферментативной депротеинизации протеиназой проводится лизис эритроцитов при сохранении целостности ДНК-содержащих клеток крови и, затем удаление мембран эритроцитов, и вместо проточных колонок для улавливания ДНК из лизата применяется суспензионный сорбент. Конечным результатом является препарат геномной ДНК, выделенной из крови, с высокой чистотой(А 260/А 2801,7-1,9) и выходом (100 мкл раствора ДНК с концентрацией 10-50 нг/мкл из 300 мкл крови). Более высокие по сравнению с прототипом технико-экономические показатели достигаются за счт следующих отличительных признаков 1) замены ферментативной депротеинизации на очистку проб от гемоглобина путм лизиса эритроцитов с последующим отделением лейкоцитарной массы, 2) очистки проб от большей части липидных соединений крови путм удаления мембран эритроцитов перед лизисом ядросодержащих клеток, 3) замены центрифужных колонок на легкодоступный суспензионный сорбент с высокой сорбционной мкостью по отношению к ДНК (не ниже 400 мкг/мг). Пример 1. Выделение геномной ДНК из человеческой крови В предлагаемом способе выделения используются буферы и растворы следующего состава Компонент 1. Буфер для лизиса эритроцитов(, ) 150 мМ хлорид аммония (4), 1 мМ бикарбонат калия (НСО 3), 0,1 мМ ЭДТАраствора доводят до 7,2. Компонент 2. Буфер для лизиса-сорбции (ВВ,1) 6 М гуанидина тиоцианат , 20 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис-НС 1, 4 Тритон Х-100 раствора доводят до 6,4. Компонент 3. Сорбент (силикагель) к 50 мл высокочистой воды (- Н 2 О) добавляют 6 г силикагеля (2,-5631). Суспендируют силикагель в воде интенсивным встряхиванием и оставляют суспензию в покое для осаждения тяжлых фракций. Через 12 ч удаляют верхние 43 мл взвеси. К оставшимся 7 мл густой суспензии силикагеля в воде добавляют 0,06 мл 10 М соляной кислоты. Суспензию встряхивают до гомогенного состояния и разделяют на аликвоты по 0,5 мл в пробирки с плотными(закручивающимися) пробками. Концентрация силикагеля в суспензии составляет 0,8 мг/мл. мкость сорбента для адсорбции ДНК не ниже 400 мкг/мг. Перед использованием аликвоты суспензии силикагеля тщательно встряхивают. Компонент 4. Раствор для отмывки белков(, ) к 260 мл буфера для лизиса-сорбции (ВВ) добавляют 700 мл этилового спирта (96) и 40 мл воды, перемешивают. Компонент 5. Буфер для отмывки солей (,1) 60 этанол, 50 мМ , 10 мМ Трис-НС, 0.5 мМ ЭДТАраствора доводят до 7,4. Компонент 6. Буфер для элюции (ЕВ, 1) 10 мМ Трис-НС, 0.5 мМ ЭДТАраствора доводят до 8,5. Способ осуществляют следующим образом К 300 мкл крови добавляют 900 мкл буфера для лизиса эритроцитов , перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 минут. Пробы центрифугируют при 2300 в течение 5 мин, при комнатной температуре. Супернатант и полужидкий ярко-красный слой мембран эритроцитов удаляют с плотного осадка лейкоцитов аспирацией пипеткой. К пробам добавляют 500 мкл , ресуспендируют осадок и повторно осаждают лейкоциты центрифугированием, как описано выше. После удаления супернатанта, получают осадок белого или кремового цвета, лейкоцитарную массу. К лейкоцитарной массе добавляют 900 мкл буфера для лизиса-сорбции (ВВ), перемешивают и инкубируют при 65 С, 10 мин. После этого пробам дают остыть до комнатной температуры и добавляют 40 мкл сорбента (Компонент 3). Смесь с сорбентом перемешивают до образования однородной суспензии и инкубируют при комнатной температуре, 10 мин. Сорбент осаждают центрифугированием (2300, 5 мин, при комнатной температуре). Удаляют супернатант. На этом этапе ДНК, выделенная из ядер лейкоцитов, находится в форме, связанной с силикагелем. Для удаления примесных компонентов (белков и липидов) проводят последовательные отмывки буферами ,и этанолом. Для этого добавляют к осадку сорбента, полученному на 3 предыдущей стадии, 900 мкл буфера для отмывки белкови ресуспендируют силикагель вдо образования однородной суспензии. Далее, сорбент осаждают изцентрифугированием, как описано выше и удаляют супернатант. К пробам (осадкам) добавляют 900 мкл буфера для отмывки солейи повторяют ресуспендирование и осаждение, как описано выше. После удаленияаспирацией добавляют к пробам 500 мкл этанола (96). Ещ раз повторяют ресуспендирование и осаждение. По окончании последней отмывки, этанол из пробирок удаляют аспирацией, а его осадки высушивают при 55 С до исчезновения видимой жидкой фазы. Последняя стадия выделения ДНК заключается в десорбции ДНК с сорбента в низкосолевой буфер при нагревании. Осадок сорбента с адсорбированной на нм ДНК ресуспендируют в 100 мкл буфера для элюции (ЕВ). Суспензию в ЕВ инкубируют при 55 С в течение 5 мин. Силикагель осаждают центрифугированием при 10,000 об/мин (9300), 5 мин. Супернатант - раствор выделенной ДНК переносят в новые пробирки, не захватывая осадок сорбента. Измеряют концентрацию ДНК на спектрофотометре и оценивают чистоту ДНК по отношению оптических плотностей на длинах волн 260 нм и 280 нм (отношение А 260/А 280 для чистой ДНК должно быть в диапазоне 1.8-2.0). Раствор выделенной ДНК используют в качестве матрицы в ПЦР без дальнейшей очистки. В Таблице 1 приведены данные по концентрации,выходу и чистоте ДНК, выделенной из 22-х проб цельной стабилизированной крови человека по способу изобретения. В Таблице 2 приведены аналогичные данные для ДНК, выделенной по способу прототипа 7,491,495 2 ( .,.,Т.), 17.02.2009,12 1/68 из крови коров, но с последующим концентрированием ДНК. Для концентрирования ДНК и замены буфера, в котором растворена ДНК,используют следующую процедуру. К пробам добавляют по 10 мкл 5 Ми 2 мкл соосадителя(декстран Т 500 в концентрации 10 мг/мл). Добавляют к пробам 350 мкл этанола (96), содержимое пробирок перемешивают. Пробирки оставляют при 20 С на 20 мин. Пробирки центрифугируют при 10,000 об/мин (9300), 10 мин, при комнатной температуре. При этом ДНК образуют видимый осадок на дне и стенках пробирки. Супернатант удаляют при помощи вакуумного аспиратора. Осадок ДНК растворяют в 20 мкл чистой воды (вода без ДНКаз с сопротивлением 18 МоМ/см). Измеряют концентрацию ДНК на спектрофотометре и оценивают чистоту ДНК по отношению 260/280. Сравнение Таблиц 1 и 2 показывает, что способ изобретения позволяет выделять геномную ДНК с выходом и чистотой не хуже, чем у препаратов,выделенных по способу прототипа, и при этом, в способе изобретения не применяются протеиназа К и центрифужные колонки. Таблица 1 Результаты выделения геномной ДНК из крови человека по способу изобретения. Выход ДНК из 300 мкл крови Таблица 2 Результаты выделения геномной ДНК из крови коров с использованием депротеинизации протеиназой К 1. Номер пробы 1 П 16 П 62 П 67 П Выход ДНК из 300 мкл крови Примечание 1 - использовали модифицированный способ описанный в 7,491,495 2 ( ., .,Т.), 17.02.2009, 12 1/68. Модификации способа 7,491,495 2 ( ., .,Т.), 17.02.2009, 12 1/68 заключались в том, что выделенную ДНК концентрировали и вместо описанных в 7,491,495 2 ( .,.,Т.), 17.02.2009,12 1/68 центрифужных колонок (спин-колонок) использовали суспензионный сорбент. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ выделения ДНК из крови, включающий обработку пробы раствором гуанидина тиоционат, адсорбцию ДНК из раствора, содержащего гуанидина тиоционат , в концентрации 1-4 М на твердый сорбент, отмывку сорбента, связанного с ДНК в растворах с убывающей ионной силой,содержащих этиловый спирт, и десорбцию ДНК с сорбента в буфер с низкой ионной силой,отличающийся тем, что перед обработкой раствором гуанидина тиоционат , в пробе крови разрушают эритроциты, после чего для удаления белков и липидов крови из пробы выделяют ДНКсодержащую фракцию, а в качестве твердой фазы используют суспензионный силикагель.