Способ выделения гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови для культивирования In vitro

(51) 61 35/14 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ МЕМв соотношение 13. клетки крови осаждают двукратным центрифугированием при 1200 об/ мин в течение 15 и 25 минут, надосадочную жидкость стерильно сливают, а объединенный осадок смешивают с лизирующим раствором в соотношении 110 и обрабатывают в течение 5 минут, затем клетки осаждают центрифугированием при 1200 об/ мин в течение 7 минут и отмывают в растворе Хенкса,с последующим ресуспендированием в питательной среде Иглас 25 аутологической сыворотки. Эффективность способа заключается в увеличении выхода живых стволовых клеток и очистки суспензии стволовых клеток от эритроцитов. Стволовые клетки, полученные из пуповинной крови предлагаемым способом, обладают всеми морфофункциональными характеристиками,хорошей жизнеспособностью,могут быть использованы для получения культур стволовых клеток, и применяться в экспериментальной биологии и медицине.(72) Кауламбаева Маржан Закановна Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Толмачев Владимир Степанович(56) Заготовка гемопоэтических стволовых клеток. Методические рекомендации. Институт стволовых клеток человека. Москва, 2007, с.22(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ ПУПОВИННОЙ КРОВИ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ(57) Изобретение относится к области биотехнологии, касается приготовления клеточных культур и может быть использовано в экспериментальной биологии и медицины для выделения стволовых клеток человека и животных. Сущность изобретения пуповинную кровь смешивают с охлажденной питательной средой Игла 23367 Изобретение относится к области биотехнологии, касается приготовления клеточных культур и может быть использовано в экспериментальной биологии и медицины для выделения стволовых клеток человека и животных. Известен способ выделения гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови для культивирования, включающий смешивание пуповинной крови с раствором и отделением стволовых клеток, при котором образец пуповиной крови равномерно смешивают с раствором полиглюкина в соотношении 11 и отслаивают при комнатной температуре в течение 30-120 мин. после оседания эритроцитов и появления четкой границы раздела осуществляют экстракцию надосадочной фракции,содержащей основную массу гемопоэтических клеток.(Заготовка гемопоэтических стволовых клеток Методические рекомендации. Институт стволовых клеток человека. Москва. 2007 г - с. 22). Недостатком способа является то, что методом седиментации не приводит к полному очищению суспензии стволовых клеток пуповинной крови от эритроцитов и уменьшает выход стволовых клеток. Наличие эритроцитов в суспензии препятствует дальнейшему культивированию стволовых клеток. Задачей изобретения является разработка способа выделения стволовых клеток пуповинной крови с большим выходом жизнеспособных клеток и максимальным удалением эритроцитов. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении выхода жизнеспособных клеток и максимальным удалением эритроцитов. Технический результат достигается тем, что осуществляют смешивание пуповинной крови с питательной средой Иглав соотношение 13,далее проводят осаждение клеток крови ступенчатым центрифугированием,осадок обрабатывают лизирующим раствором в течение 5 минут, затем клетки осаждают и отмывают в растворе Хенкса. с последующим ресуспендированием в питательной среде Иглас 25 аутологической сыворотки. Эффективность способа заключается в увеличении выхода живых стволовых клеток и очистки суспензии стволовых клеток от эритроцитов. Способ осуществляется следующим образом Пуповинную кровь равномерно смешивают с охлажденной до 2-4 С питательной средой Иглав соотношении 13 для уменьшения вязкости крови. Затем центрифугируют при 1200 об/ мин в течение 15 мин ( 5). Надосадочную жидкость,представляющую собой питательную среду с 25 сыворотки ПК, осторожно сливают или собирают шприцом с соблюдением условий стерильности. Затем проводят повторное центрифугирование надосадочной жидкости для полного осаждения клеток крови и осветления жидкости при 1200 об/мин в течение 25 мин ( 5). После центрифугирования надосадочную жидкость сливают в стерильный флакон и используют в дальнейшем для культивирования или криоконсервации клеток. Полученные осадки объединяют и ресуспендируют с холодным лизирующим раствором в соотношении 110. Продолжительность обработки 5 мин. Затем суспензию клеток повторно центрифугируют при 1200 об/мин в течение 7 мин. Гемолизированную надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют с раствором Хенкса для отмывки клеток от остатков гемолизата и лизирующего раствора, которые могут быть токсичными для клеток и центрифугируют при тех же параметрах. Надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют питательной средой Игла. С 25 аутологической сыворотки ПК. Часть суспензии клеток используют для бактериологических анализов,определения концентрации ядрсодержащих клеток (ЯСК) и мононуклеарных клеток (МНК), определения процента жизнеспособных клеток, определения концентрации ГСК по маркерам 34,38 и 45. Оставшаяся часть суспензии клеток используют для дальнейшего культивированияили криоконсервапии. Эффективность способа заключается в увеличении выхода живых клеток и очистки суспензии стволовых от клеток эритроцитов. Таблица 1 Сравнительная эффективность выделения стволовых различными способами клеток Способ Общий Общий Содержание Процент МНК в выделения выход выход эритроцитов выхода образце х стволовых ЯСК МНК в образце П 103/см 3 5 9 3 клеток х 10 клеток х 10 клеток х 10 /см До сепарации Старый способ Предложен ный способ 23367 Как видно из таблицы 1, наиболее оптимальным методом выделения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови является обработка лизирующим раствором. В этом случае наблюдается наибольший процент выхода ядросодержащих(ЯСК) и мононуклеарных клеток (МНК) и значительное уменьшение содержания эритроцитов в суспензии. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ выделения гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови для культивирования, включающий смешивание пуповинной крови с раствором и отделением стволовых клеток,отличающийся тем, что в качестве растворителя используют питательную среду Игла, отделение стволовых клеток осуществляют ступенчатым центрифугированием, при следующих параметрах смешивание пуповинной крови с питательной средой Иглаа проводят в соотношении 13, осаждение клеток крови проводят ступенчатым центрифугированием, сначала 1200 об/мин в течение 15 мин ( 5 С), затем при 1200 об/мин в течение 25 мин ( 5 С), полученный осадок обрабатывают лизирующим раствором в течение 5 минут, затем клетки осаждают при 1200 об/мин в течение 7 мин и отмывают в растворе Хенкса, с последующим ресуспендированием в питательной среде Иглас 25 аутологической сывороткой