Способ выделения и культивирования гемопоэтических стволовых клеток из костного мозга и пуповинной/плацентарной крови человека

(51) 01 33/49 (2006.01) 12 5/08 (2006.01) 12 5/20 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН гемопоэтических стволовых клеток человека с фенотипами 34 и 133 позитивных клеток и может быть использовано для выделения и культивирования, с целью получения максимального количества клеток достаточного для трансплантации в клеточнозаместительной терапии. Сущность изобретения способ осуществляется путем выделения ядро-содержащих клеток из костного мозга и пуповинной/плацентарной крови человека с последующим выделением ГСК с фенотипами 34 и 133 клеток на иммуномагнитном сепараторе. Культивирование осуществляется в питательной среде ДМЕМ/12,содержащей фактор роста стволовых клетокв дозе 160 нг/мл, -3 в дозе 100 нг/мл и интерлейкин 3 и 6 по 80 нг/мл. Культивирование ГСК человека с фенотипами 34 и 133 клеток в условиях СО 2- инкубатора при температуре 37,0 С в течение 21 сут приводит к получению клеток с 17 кратным приростом. Определение специфичности культивированных ГСК с фенотипами 34 и 133 клеток методом проточной цитофлуориметрии показывает, что популяция клеток состоит на 86,6 из однотипных кроветворных клеток гемопоэтического ряда.(72) Мамадалиев Сейдигапбар Мамадалиевич Битов Нурзат Тынышбекович Наханов Азиз Куралбаевич Ибраимова Никар Маликовна Сейдалин Арыстан Оскарович Жумабаева Баян Абильмажиновна Кодасбаев Алмат Турысбекович(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ КОСТНОГО МОЗГА И ПУПОВИННОЙ/ПЛАЦЕНТАРНОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА 22201 Изобретение относится к клеточной биотехнологии и может быть использовано для выделения и культивирования гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) из костного мозга и пуповинной/плацентарной крови человека. Одно из главных препятствий широкому применению в клинике взрослых стволовых клеток проблемы с их размножением вне организма. Истинных плюрипотентных стволовых клеток во взрослых тканях крайне мало, а когда их удается выделить и перевести в лабораторную культуру, они быстро начинают дифференцироваться в специализированные клетки той ткани, из которой были получены. При этом утрачивается одно из самых ценных их свойств - возможность превращаться в клетки других типов. Поэтому размножить взрослые стволовые клетки без потери ими стволовости до сих пор было почти невозможно Г. Т. Сухих. Трансплантация фатальных тканей и клеток. Сборник научных трудов Российской академии медицинских наук. Москва, 1998 г Задачей изобретения является выделение из костного мозга и пуповинной/плацентарной крови человека ГСК с фенотипами 34 и 133 позитивных клеток и определение оптимального состава ростовой среды, необходимой для длительного культивирования ГСК. Существует способ.. //.22-2006 увеличить число стволовых клеток без изменения их качеств в 30 раз - это в 10 раз больше,чем удавалось кому бы то ни было до сих пор. Изучая ГСК фетальных тканей мыши, ученые обнаружили популяцию клеток, которые сами не были стволовыми, но взаимодействовали с ними,позволяя им делиться и сохраняя их стволовость. При совместном культивировании этих новооткрытых клеток со стволовыми, последние хорошо размножались в культуре. Недостатком указанного способа является использование ГСК из фетальных тканей,применение которых подвержено серьезным юридическим и этическим проблемам, поскольку источниками их получения является абортированный материал. Кроме того,в достижении такой сложной задачи основную роль сыграло наличие высокотехнологического оборудования и дорогостоящих факторов роста. Отличием предлагаемого нами способа является использование ГСК из костного мозга и пуповинной/плацентарной крови человека. После взятия образцов костного мозга,пуповинной/плацентарной крови проводили выделение ядросодержащих клеток методами градиентного центрифугирования на - с плотностью ,077 г/мс последующим выделением 34 и 133 ГСК путем магнитной сепарации. Н.М. Ибраимова, А. К. Наханов, Н.Т. Битов и др. Изучение влияние ростовых факторов при культивировании гемопоэтических стволовых 2 клеток человека. Журнал Трансплантология. Том 10, 1. с.130-134, Киев, 2008 год. Для подбора оптимальной питательной среды культивирования ГСК использовали среды ПСП,/12, -15 и -1640, содержащие 10-20 фетальной сыворотки КРС, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. В качестве добавок в питательные среды были использованы фактор роста стволовых клеток ,-, интерлейкины 3 и 6 (-3, -6). Клетки высевали в культуральные 24-луночные плашки. Смену среды и определение прироста клеток производили через 3-4 суток культивирования. Подсчет клеток и определение жизнеспособных клеток производили окрашиванием суспензии клеток 0,1 раствором трипанового синего. Суспензию 34 и 133 клеток в питательной среде /12 перемешивали с 1,1 мл средыс концентрацией 0,52,0 х 106 клеток на 35 мм чашку Петри. Культивирование проводили при 37 С в увлажненной атмосфере, содержащей 5 СО 2 в течение 14-16 дней. По истечении этого срока подсчитывали количество колоний и количество клеток в колонии с помощью инвертированного микроскопа. Фенотипическое и цитоморфологическое изучение ГСК 34 и 133 проводили на проточном цитофлуориметрена 14-20 сутки культивирования. Культивирование в питательной среде/12 34 клеток на 7 сут приводило к 7 кратному увеличению содержания клеток с вышеприведенным фенотипом. К 3 неделе культивирования был отмечен 17-кратный прирост клеток. В остальных средах этот показатель был существенно ниже. В связи с этим последующее культивирование ГСК проводились в питательной среде /12, содержащей фактор роста стволовых клетоки цитокины в указанных дозах. Цитоморфологически на первые сутки культивирования 34 клетки преимущественно были однородной, округлой формы со средним размером до 6-8 мкм в диаметре. Большинство клеток находилось во взвешенном состоянии, т.е. они не прикреплялись ко дну культурального пластика. По мере увеличения сроков культивирования клетки увеличивались в размерах и образовывали колонии из нескольких клеток,которые также находились во взвешенном состоянии. 133 клетки выделенные из пуповинной крови в культуре, также были однородной и округлой формы, более крупного размера (до 10 мкм) по сравнению с 34 клетками, изредка встречались клетки удлиненной и округлой формы. Кроме того,при микроскопии отмечали образование таких же колоний как в культуре 34 клеток. На 5-6 сутки культивирования отмечали образование прикрепленных клеток палочковидной и веретеновидной формы. 22201 Для анализа колониеобразующих единиц в культуре ГСК проводили культивирование их в питательной среде, содержащей 1. В результате 34 клетки в среде образовывали колонии, содержащие более 40 клеток крупного размера, округлой формы, характеризующихся как гранулоциты и макрофаги. Кроме того,образовывались колонии, состоящие из клеток,расположенных компактно. При микроскопии нативной культуры эти колонии имели краснобурую окраску и были представлены эритробластоидными клетками. 133 клетки в средеобразовывали колонии, состоящие из более чем 100 клеток округлой формы, множество колоний,состоящих из 10 клеток, а также отмечали единичные клетки. Эти колонии образованы клетками преимущественно гранулоцитарного и макрофагального ряда. На 14-20 сутки культивирования ГСК были проведены исследования клеток с фенотипом 34 и 133 на проточном цитофлуориметре. Данные, полученные при культивировании ГСК,свидетельствуют, что питательная среда /12 в совокупности с факторами роста и цитокинами приводит к 17-кратной экспансии ГСКна 3 неделе культивирования. В качестве добавок к питательной среде использовали факторы роста и цитокины с подобранными нами прописями. В результате было выявлено,что при культивировании ГСК обязательным условием является наличие в питательной среде факторов роста и цитокинов в отработанных нами дозах. Культивированные ГСК в полутвердой среде образуют колонии гранулоцитарных,макрофагальных, моноцитарных и эритроидных клеток кроветворного ряда. Цитологические исследования показали однородность клеточного состава культивированных ГСК, состоящая на 86,6 из однотипных клеток гемопоэтического ряда. Таким образом, предлагаемый нами способ может быть применн для эффективного выделения ГСК с фенотипами 34 и 133 из костного мозга и пуповинной/плацентарной крови и культивированияс целью получения максимального количества клеток достаточного для трансплантации в клеточно-заместительной терапии. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ выделения и культивирования гемопоэтических стволовых клеток из костного мозга и пуповинной/плацентарной крови человека,включающий выделение ГСК из фракции ядросодержащих клеток путем магнитной сепарации и культивирования, отличающийся составом питательной среды, содержащей фактор роста стволовых клетокв дозе 160 нг/мл,3 в дозе 100 нг/мл и интерлейкинов 3 и 6 ( 3,- 6) по 80 нг/мл.