Способ исследования мышечной ткани рыб на наличие паразитов

(51) 01 33/12 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ наличие метацеркариев, описторхов и других паразитов, могущего заменить компрессорий,обеспечить исследование как свежих, так и фиксированных образцов тканей, обезопасить от инфекций и частично дезинвазировать объекты,обеспечить сохранность материала в течение достаточно долгого времени. Способ исследования объектов на наличие тканевых паразитов заключается в том, что свежие или фиксированные образцы мышц выдерживают в 30-40 растворе уротропина(гексаметилентетрамина) от 1-2 часов до 1-2 недель,затем компрессируют между предметными стеклами и просматривают визуально или под бинокулярной лупой. Для длительного хранения образцов добавляют 15-20 хлорида натрия или 0,5-1 лимонной или ацетилсалициловой кислоты (которая выделяет из уротропина небольшое количество формальдегида, подстраховывая при длительном хранении).(72) Дюсембаев Сергазы Турлыбекович Ермухамбетова Жазира Тарасовская Наталья Евгеньевна(56) Котельников Г.А. Гельминтологические исследования животных и окружающей среды. Справочник. М. Колос, 1983, с.208(54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ РЫБ НА НАЛИЧИЕ ПАРАЗИТОВ(57) Изобретение относится к области биологии,ветеринарии и ветсанэкспертизы, в частности, к способам исследования мышечной ткани рыб на наличие личиночных форм паразитов. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в разработке технически несложного, осуществимого в лабораторных и экспедиционно-полевых условиях, нетрудоемкого,надежного способа исследования тканей рыб на Изобретение относится к области биологии,ветеринарии и ветеринарно-санитарной экспертизы,в частности, к способам исследования мышечной ткани рыб на наличие личиночных форм паразитов. Известен способ исследования мышечной ткани рыб на наличие паразитов путем расщепления мышечных волокон тупым концом скальпеля таким способом можно найти инцистированные метацеркарии и молодых нематод филометроидесов Васильков Г.В. Гельминтозы рыб. - М. Колос,1983.-208 с. с. 33. Недостатком данного способа является возникновение угрозы повреждения личиночных форм и затруднение точного определения таксономического статуса или видовой принадлежности гельминта. Наиболее близким к изобретению является способ исследования мышечной ткани и тканей паренхиматозных органов на наличие паразитов заключающийся в раздавливании образца с помощью компрессорного стекла, взятый за прототип, который описан во многих источниках Котельников Г.А. Гельминтологические исследования животных и окружающей среды Справочник. - М. Колос, 1983. - 208 с., ил. с. 130 исследование мяса на трихинеллез, с. 174 исследование рыбы на описторхоз. Недостатком данного способа является необходимость использования специального, пусть и простого по устройству, прибора. Компрессорий доступен не всегда, к тому же отличается высокой стоимостью, требует навыков работы и может выйти из строя. Для компрессирования требуются тонкие кусочки ткани, а это значит, что при низкой интенсивности инвазии личинки могут не выявиться или же потребуется компрессия значительного числа образцов. Традиционное исследование на компрессорий требует очень мелких и тонких образцов исследуемого материала для мяса Котельников Г.А. (с. 130) рекомендует делать по 12 срезов величиной с овсяное зерно для рыбы (с. 174)- снимается поверхностный слой мышц толщиной 0,2-0,5 см, нарезается мелкими кусочками и размещается по поверхности компрессорного стекла. При низкой интенсивности инвазии(единичные личинки) паразиты могут не выявиться в малом количестве материала. Морфология личинок при компрессорном исследовании не всегда позволяет точно установить их видовую принадлежность или хотя бы таксономический статус часто требуется дополнительное просветление или исследование с перевариванием в искусственном желудочном соке (что требует дополнительных затрат труда, времени и реактивов). Кроме того, работа с нативным материалом может быть небезопасна для исследователя, так как ряд личиночных форм гельминтов рыб при недостаточном уровне гигиены может инвазировать человека пероральным путем, и к тому же велик риск передачи бактериальных инфекций. Фиксированные образцы тканей не годятся для компрессорного исследования,а работа 2 непосредственно со свежим материалом не всегда возможна (в экспедиционно-полевых условиях может не оказаться компрессория, времени и возможностей для ларвоскопии тканей. Хранение свежих образцов до исследования в лабораторных условиях не всегда возможно (для этого требуются холодильные установки или естественные источники холода). Некоторые патофизиологические изменения тканей могут сделать их ригидными, жесткими, непрозрачными,что затрудняет компрессирование и просмотр. Целью изобретения является разработка простого по исполнению, дешевого, доступного в любых условиях,надежного способа ларвоскопического исследования тканей рыб,могущего заменить приборы, обезопасить объекты от ряда инфекционных и инвазионных агентов и обеспечить сохранность материала в течение достаточно длительного времени, а также сделать возможным компрессорное исследование фиксированного в формалине материала. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в разработке технически несложного, осуществимого в лабораторных и экспедиционно-полевых условиях, нетрудоемкого,надежного способа исследования тканей рыб на наличие метацеркариев, описторхов и других паразитов, могущего заменить компрессорий,обеспечить исследование как свежих, так и фиксированных образцов тканей, обезопасить от инфекций и частично дезинвазировать объекты,обеспечить сохранность материала в течение достаточно долгого времени. Способ исследования объектов на наличие тканевых паразитов заключается в следующем. Образцы тканей толщиной 2-10 мм помещают в 3040 раствор технического уротропина гексаметилентетрамина (сухого горючего) на срок от 1-2 ч до 1-2 недель, после достижения мягкости и прозрачности компрессируют между предметными стеклами и просматривают под бинокулярной лупой. Пример 1 - мышечную ткань рыбы разрезают на слои толщиной 2 мм и образцы помещают в 30 ный раствор технического уротропина гексаметилентетрамина (сухого горючего) и выдерживают в течение 1 часа. Затем раздавливают каждый кусочек ткани между двумя предметными стеклами и просматривают визуально или под бинокулярной лупой при увеличении от 818 до 8756 раз. Пример 2 - мышечную ткань рыбы разрезают на слои толщиной 10 мм и образцы помещают в 40-ный раствор технического уротропина гексаметилентетрамина (сухого горючего) и выдерживают в течение 2 часов. Затем раздавливают каждый кусочек ткани между двумя предметными стеклами и просматривают визуально или под бинокулярной лупой при увеличении от 818 до 8756 раз. Пример 3 - мышечную ткань рыбы разрезают на слои толщиной 5 мм и образцы помещают в 35-ный раствор технического уротропина 25156 гексаметилентетрамина (сухого горючего) и выдерживают в течение 1,5 часа. Затем раздавливают каждый кусочек ткани между двумя предметными стеклами и просматривают визуально или под бинокулярной лупой при увеличении от 818 до 8756 раз. По мере того, как образцы станут мягкими,эластичными и полупрозрачными, раздавливают каждый кусочек ткани между двумя предметными стеклами (что не потребует значительных физических усилий) и просматривают визуально или под бинокулярной лупой при увеличении от 818 до 8756 раз. Тонкие,хорошо просветлившиеся полоски мышц можно просматривать визуально, без компрессии (особенно если паразиты, например, метацеркарии трематод,Пример Концентрация Толщина уротропина слоя ткани 1. 30 2 мм Как видно из таблицы, условия примера 2(толщина слоя ткани до 10 мм при увеличении выдержки и концентрации раствора уротропина) увеличивает вероятность выявляемости личинок,особенно при низкой интенсивности инвазии, но просветление при этом достигается не такое полное,как при толщине 2-5 мм. Наиболее оптимальными являются условия примера 2, когда при толщине слой исследуемой мышечной ткани 5 мм достигается достаточный объем исследуемой ткани,снижается время экспозиции и сама концентрация раствора, образец быстро становится прозрачным и пригоден даже для визуального исследования. Механизмы действия предлагаемых веществ 1. Оптическая активность гексаметилентетрамина обеспечивает просветление всех растительных и животных тканей. Наличие асимметричного атома углерода в карбамиде (как и других органических соединениях с такими же свойствами) приводит к вращению плоскости поляризации света. 2. Слабощелочной (по сути, буферный) характер карбамида приводит к омылению жироподобных веществ (в том числе частичной деструкции фосфолипидных биологических мембран),щелочной денатурации и частичному гидролизу белков. 2-й и 3-й из названных факторов нарушают функции белков и других органических веществ - не достаточно крупные и хорошо видимые простым глазом). В растворе технического уротропина гексаметилентетрамина (сухого горючего) ткани могут храниться 1-2 недели и более. Для более длительного хранения образцов (без приобретения ими ригидности и потери прозрачности) до нескольких месяцев или лет добавляют 15-20 хлорида натрия, другой хорошо растворимой соли или 0,5-1 лимонной или ацетилсалициловой кислоты(которая при взаимодействии с уротропином выделяет небольшое количество формальдегида). Результаты испытаний уротропина различной концентрации и при различной выдержке показаны в нижеследующей таблице. Состояние ткани Прозрачная,мягкая Возможность Выявлено работы с ней паразитов Хорошо просматривается 3 личинки насквозь визуально и легко описторха в раздавливается между 2 образце предметными стеклами. Прозрачная, Удовлетворительно 10 личинок мягкая просматривается описторха в визуально и раздавливается образце между 2 предметными стеклами без значительных физических усилий до тонкого слоя. Прозрачная, Хорошо просматривается 6 личинок мягкая визуально и легко описторха в раздавливается между образце предметными стеклами до тонкого слоя. только самих тканей, но и микроорганизмов и паразитов, что обеспечивает более мягкую консистенцию тканей по сравнению с естественной,а также дезинфекцию и отчасти - дезинвазию объекта, что делает образцы сырой рыбы безопасными для здоровья работающих. 4. Высокая концентрация гексаметилентетрамина,являющегося хорошо растворимым в воде веществом, (дающая высокое онкотическое давление раствора) в сочетании с высоким осмотическим давлением хлорида натрия обеспечивают сохранность объекта за счет уничтожения и угнетения жизнедеятельности микроорганизмов. Добавление органических кислот(лимонной или ацетилсалициловой) обеспечивает длительную сохранность объекта за счет кислотной денатурации белков, консервирующих свойств салицилатов, а также частичном выделении формальдегида за счет взаимодействия уротропина с кислотой. Концентрация формальдегида в этом случае мала, чтобы вызвать ригидность объектов или аспирацию работающими людьми, но вполне достаточна для подстраховки объектов от порчи(наряду с онкотическим давлением раствора и другими факторами коагуляции белков). 5. Уротропин связывает дурнопахнущие продукты разложения белков меркаптаны), обеспечивая дезодорацию материала и предотвращая появление неприятных запахов. Преимущества предложенного способа исследования тканей 1. Достигается быстрое и сильное просветление ткани, позволяющее увидеть паразитов и другие включения визуально, а при тонких кусочках ткани обойтись без компрессии. Это позволит не только выявить сам факт наличия паразита, но и установить его видовой статус на основании морфологии внутренних структур. 2.Размягчение ткани (без ее деформации и деформации паразитов) позволяет провести компрессию без компрессория, между предметными стеклами, не прилагая значительных физических усилий. 3. Предложенный способ обеспечивает возможность компрессорного исследования не только свежего, но и фиксированного материала - за счет того, что уротропин (синтезируемый в промышленности из формальдегида и аммиака) может поглощать избыток формалина. Фиксированный в формалине материал утрачивает запах, ригидность, в течение времени от 2-3 часов до суток (в зависимости от концентрации формалина и величины объекта) размягчается и становится прозрачным. 4. В экспедиционно-полевых условиях появляется возможность достаточно длительного хранения, если нет возможности исследовать свежий материал сразу 1-2 недели объект может находиться в уротропине без излишнего размягчения тканей, несколько месяцев или лет - с добавлением 15-20 хлорида натрия или 0,5-1 ацетилсалициловой или лимонной кислоты. 5. Уротропин, а также добавляемые в него лимонная или ацетилсалициловая кислоты обеспечивают дезодорацию материала - если он дурнопахнущий или уже подвергся порче и частичному разложению - с полным устранением всех неприятных запахов. 6. При выдерживании нативных тканей в уротропине достигается дезинфекция и частичная дезинвазия материала(за счет высокого онкотического давления и антисептических свойств уротропине, ради которых он традиционно используется в медицине). Обработанный таким образом материал безопаснее для здоровья исследователя (особенно в экспедиционно-полевых условиях), чем нативные образцы, используемые для исследования на компрессории. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ исследования мышечной ткани рыб на наличие паразитов, включающий подготовку проб и компрессирование, отличающийся тем, что образцы мышц разрезают на слои толщиной от 2-х до 10-ти мм, выдерживают в 30-40-ном растворе технического уротропина (гексаметилентетрамина) в течение 1-2 часов, затем компрессуют между двумя предметными стеклами и просматривают визуально или под бинокулярной лупой. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для обеспечения длительного хранения образцов добавляют 15-20-ный раствор хлорида натрия или 0,5-1 лимонной или ацетилсалициловой кислоты. 3. Способ по п.1. отличающийся тем, что могут исследоваться как свежие, так и фиксированные образцы мышечной ткани.