Способ прогнозирования течения хронического вирусного гепатита С в казахской популяции

(51) 01 33/48 (2009.01) 12 1/68 (2009.01) 12 15/24 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ гепатита С путем исследования крови больного,анализа комбинации полиморфизмов генов цитокинов, включающий получение образца геномной ДНК больного, тестирование указанной ДНК на наличие аллелей, оценку результатов и составление заключения о вероятности прогрессирующего течения заболевания, согласно изобретению, исследуют кровь больных казахской популяции, в которой определяют полиморфизм генов цитокинов 1 и ИЛ-10, дополнительно определяют ген ангиотензиногена АТ-6 и при выявлении гомозиготного наследования генотипа 25 гена 1, гомозиготного наследования аллели С кодона -595 гена ИЛ-10 прогрессирование хронической -инфекции в цирроз печени при выявлении гомозиготного генотипа / 25 кодона гена 1, гомозиготного генотипа А/А кодона -1082, генотипа С/С кодона -819 гена ИЛ-10,гомозиготного генотипа С/С кодона-595 гена ИЛ-10,гомозиготного генотипа Т/Т гена ангиотензиногена АТ-6 развитие декомпенсированного цирроза печени при хроническом гепатите С.(72) Ильясова Бибигуль Сапарбековна Ермекова Лилия Ерлановна(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С В КАЗАХСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ(57) Изобретение относится к медицине, в частности к внутренним болезням и может быть использовано для выявления генетических факторов,способствующих прогрессированию хронических вирусных гепатитов в цирроз печени у пациентов казахской популяции. Техническим результатом изобретения является повышение информативности и точности прогнозирования процесса в печени при хроническом гепатите. Это достигается тем, что в заявляемом способе прогнозирования течения хронического вирусного Изобретение относится к медицине, в частности к внутренним болезням и может быть использовано для выявления генетических факторов,способствующих прогрессированию хронических вирусных гепатитов в цирроз печени у пациентов казахской популяции. Гепатит С имеет тенденцию к хронизации, что приводит к фиброзу печени с последующим формированием цирроза и первичному раку печени. Хронический гепатит С (ХГС) является ведущей формой хронических заболеваний печени с неуклонно прогрессирующим течением и характеризуется значительной межиндивидуальной вариабельностью клинической картины и исходов. Основной причиной смертности больных ХГС является цирроз печени, скорость формирования которого варьирует от нескольких лет до нескольких десятков лет. Несмотря на то, что к настоящему времени установлено большое число факторов риска прогрессирующего течения ХГС,практикующие специалисты отмечают крайнюю сложность предсказания естественного течения заболевания и его прогноза у конкретного больного. В условиях ограниченной эффективности противовирусной терапии,большого числа нежелательных явлений на фоне лечения, вопрос об установлении индивидуального риска прогрессирования заболевания до стадии цирроза печени приобретает особую актуальность и диктует необходимость поиска дополнительных предикторов прогрессирования ХГС. Известен способ диагностики и прогнозирования течения гепатита С путем анализа венозной крови и определения неструктурного слитого гена 3/4 вируса гепатита С.(Патент США 7226912, МПК А 61 К 48/00,опубл. 05.06.2007 г.) Недостатки заключаются в том, что в данном способе исследуется ген вируса и данный способ не позволяет прогнозировать как генетически обусловленный иммунный ответ наинфекцию,так и формирование тяжелых осложнений цирроза печени. Известен также способ прогнозирования прогрессирующего течения хронического гепатита С (развития цирроза печени) путем анализа комбинации полиморфизмов генов цитокинов,включающий а) получение образца геномной ДНК больного ХГС, б) тестирование указанной ДНК на наличие аллелей,ассоциированных с прогрессированием фиброза, в) оценку результатов и составление заключения о вероятности прогрессирующего течения заболевания,отличающийся тем, что ДНК анализируют на наличие полиморфизмов генов цитокинов (-511) С/Т-, (-174) / -6 и (915) / -1. При этом установлено, что генотипы (-511) ТТ гена -, (174) СС гена -6 и (915)гена характеризуются выраженным профибротическим действием генотипы (-511) СТ гена - и (-174)гена -6 - умеренным профибротическим действием генотипы (-511) СС гена -, (-174)гена -6 - протективным действием в отношении(Патент РФ 2317335, МПК 12 1/68, 12 15/24, опубл. 20.02.2008 г.) Недостатком данного способа является то, что он основан на анализе только комбинации полиморфизмов генов цитокинов,которые модулируют контроль иммунного ответа наинфекцию -полиморфизмы генов ИЛ -1, ИЛ-6, и которые участвуют в патологическом повреждении печеночной ткани и фиброзообразовании полиморфизм гена -. Но в данном способе отсутствуют исследования генов, участвующих в развитии клиники декомпенсированного цирроза,обусловливающих развитие портальной гипертензии,варикозного расширения вен пищевода, отечно-асцитического синдрома. Задачей изобретения является создание информативного способа прогнозирования течения хронического вирусного гепатита С в казахской популяции,способствующего улучшению диагностики прогрессирования заболевания и индивидуализации противовирусной терапии. Техническим результатом изобретения является повышение информативности и точности прогнозирования процесса в печени при хроническом гепатите. Это достигается тем, что в заявляемом способе прогнозирования течения хронического вирусного гепатита С путем исследования крови больного,анализа комбинации полиморфизмов генов цитокинов, включающий получение образца геномной ДНК больного, тестирование указанной ДНК на наличие аллелей, оценку результатов и составление заключения о вероятности прогрессирующего течения заболевания, согласно изобретению, исследуют кровь больных казахской популяции, в которой определяют полиморфизм генов цитокинов 1 и ИЛ-10, дополнительно определяют ген ангиотензиногена АТ-6 и при выявлении гомозиготного наследования генотипа 25 гена 1, гомозиготного наследования аллели С кодона -595 гена ИЛ-10 прогрессированис хронической - инфекции в цирроз печени при выявлении гомозиготного генотипа / 25 кодона гена 1, гомозиготного генотипа А/А кодона -1082, генотипа С/С кодона -819 гена ИЛ-10,гомозиготного генотипа С/С кодона -595 гена ИЛ 10,гомозиготного генотипа Т/Т гена ангиотензиногена АТ-6 развитие декомпенсированного цирроза печени при хроническом гепатите С. Известно,что ключевую роль в прогрессировании фиброза у больных ХГС играют особенности иммунного ответа организма хозяина на патоген, поэтому исследовали полиморфизм генов цитокинов,особенно функционально значимые для быстрого развития фиброза. Цитокины - группа гормоноподобных белков и пептидов,синтезируемых и секретируемых клетками иммунной системы и другими типами клеток. Основные биологические функции цитокинов связаны с регуляцией развития и 2 гомеостаза иммунной системы, контролем за ростом и дифференцировкой клеток и участием в неспецифических защитных реакциях организма. В свете решаемой задачи особый интерес представляют цитокины, участвующие в таких процессах, как воспаление, регенерация гепатоцитов и фиброгенез,типичными представителями которых, в частности, являются -10 и 31. Поскольку считается, что до 50 индивидуальных различий в продукции цитокинов обусловлено наличием полиморфизмов(однонуклеотидных замен в пределах гена), закономерно было ожидать,что полиморфизмы, связанные с изменением продукции названных цитокинов,могут модифицировать естественное течение ХГС и служить маркерами прогрессирующего или доброкачественного течения заболевания. Первичное действие ренинангиотензиновой системы(РАС) заключается в регуляции сосудистого тонуса и экскреции солей почками. Поскольку полимофризм генов РАС ассоциируется с повышенной выработкой ангиотензина , он может ассоциироваться с прогрессирующим циррозом печени и усилением отечно-асцитического синдрома при формировании портальной гипертензии. Учитывая влияние РАС на формирование фиброза и участие в патогенезе тяжелых осложнений цирроза печени изучение полиморфизмов гена АТ 6 при вирусном гепатите С позволяет определить генетические предикторы прогрессирования вирусного гепатита С. Способ осуществляется следующим образом. Диагноз ХГС устанавливают на основании данных анамнеза, клинического обследования,результатов лабораторных методов диагностики,включая вирусологическое исследование(позитивные тесты на антитела к вирусу гепатита С и) и морфологического исследования печени. У пациента берут 5 мл венозной крови и проводят генетический анализ. Для выделения ДНК используют(, ) согласно протоколам производителя с модификацией лаборатории генетики Центра биотехнологий МОН РК. Генотипирование полиморфизмов проводят методом прямого секвенирования в обоих направлениях. Для сиквенс реакций используют 3.1(, ). Секвенирование ДНК проводят на приборе ДНК анализаторе 3730 (,, , ). Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводят с использованием пакета программ(5.3.1, . 2.6, и др.),1.3.1. и с использованием международных баз нуклеотидных последовательностей (, ,и др.). На последнем этапе 80 нг образцов ДНК пациентов были амплифицированы в присутствии 0,5 микромоль праймера 25- 5--3, 0.5 М 25- 5--3, 0.225--640-5-(-)-3, 0.225 5-(-3)-, 312, 5 (/) , -112 . Проводят статистическую обработку результатов. Данные представляют как среднее арифметическое со стандартным отклонением. Статистическая значимость различий для количественных признаков в случае нормального распределения последних оценивают с помощью критерия. Уровень значимости был принимают р 0,05. Клинически значимую хроническуюинфекцию класс А (компенсированный цирроз) ассоциируют с гомозиготным наследованием генотипа 25 гена 1, гомозиготным наследованием аллели С кодона-592 гена ИЛ-10. Развитие(декомпенсированный цирроз) ассоциируют с выявлением гомозиготного генотипа / 25 кодона гена 1, гомозиготного генотипа А/А кодона -1082, генотипа С/С кодона -819 гена ИЛ-10,гомозиготного генотипа С/С кодона -595 гена ИЛ 10,гомозиготного генотипа Т/Т гена ангиотензиногена АТ-6. Пример 1. Пациентка Ж., 1956 г.р. находилась на стационарном лечении с 17.09.09. по 02.10.09. с диагнозом Основной Хронический вирусный гепатит С,РНК-позитивный, умеренной активности. Сопутствующий Хронический панкреатит со сниженной внешнесекреторной функцией. Обострение. Жалобы на общую слабость, постоянные боли в правом подреберье опоясывающего характера.от 18.09.09. Нв 111 г/л, Эритроциты 4,01012 /л, ЦП 0,83, лейкоциты 9,0109/л, пя 1, ся 49, моноциты 7, эозинофилы 3 лимфоциты 40, СОЭ 7 мм/ч в динамике от 29.09.09. Нв 128 г/л,Эритроциты 4,51012/л, ЦП 0,96, тромбоциты 192 х 10 9 /л, лейкоциты 4,5109/л, пя 2, ся 65,моноциты 4, эозинофилы 6 лимфоциты 23,СОЭ 7 мм/ч ОАМ от 29.09.09 120 мл , цвет прозр, УВ 1015,белок - 0, лейкоциты един, плоск. эпит.- единич. в п/зр. Биохимический анализ крови от 18.09.09. мочевина 3,0 ммоль/л, креатинин 60 ммоль/л,глюкоза 4,3 моль/л, АЛТ 106,0 (до 31),123,6(до 36), холестерин 2,7 ммоль/л, триглицериды в динамике от 03.06.09. общий белок 73.5 гл,мочевина 2,7 ммоль/л, креатинин 53 ммоль/л,глюкоза 3,4 моль/л, АЛТ 21,3 (до 41),50,0 (до 36), билирубин 38,0-17,8-20,2, Коагулограмма от 03.06.09 проторомбиновый индекс 70, Внафтолоновый тест пол, этаноловый-отр. Гормоны щитовидной железы Тзсвоб. - 2,13 (1,33,1) нмоль/л, Т 4 своб-90,25 (66-181) нмоль/л, ТТГ 2,52 (0,27-4,2 )/. Исследование крови на определение маркеров вирусных гепатитовотриц.,отриц,3 аНВсо суммарные положит, аНВе-отриц,положит-отриц, суммарные положит,-отриц,отриц. Результаты исследования полиморфизма генов Гена ИЛ-10 кодона -1082 обнаружен генотип/ Кодона -819 гена обнаружен генотип С/Т Кодона - 595 гена обнаружен генотип А/С Гена ангиотензиногена АТ-6 обнаружен генотип С/Т 25 кодона гена 1 обнаружен генотип/ По полученным результатам можно судить о течении заболевания без осложнений. Пример 2 Пациент К., 1961 г.р. находился на стационарном лечении в 1 терапевтическом отделении с 14.03.08. по 25.03.08. с диагнозом Основной диагноз Цирроз печени в исходе вирусного гепатита С, класс А(-). Печеночная энцефалопатия. Хронический панкреатит, обострение. Вторичный Т-клеточный иммунодефицит, средней степени тяжести, декомпенсация. Сопутствующий диагноз Хронический холецистит,обострение. Рефлюкс-эзофагит,химический рефлюкс-гастродуоденит, обострение. Хронический простатит, неполная ремиссия. Поступил с жалобами на выраженную слабость,плохой сон, перепады настроения, постоянные боли в подложечной области,периодически приобретающие опоясывающий характер, боли в правом подреберье, жидкий стул, иногда вздутие живота,Из анамнеза болен с 2002 года, когда был выставлен диагноз хронический вирусный гепатит С в фазе репликации, проведен курс противовирусной терапии (пегасис, копегус). Фаза интеграции наступила через 27 недель лечения. В течение последних 1,5 года стали беспокоить боли в животе опоясывающего характера. Неоднократно лечился по поводу хронического панкреатита в стационарных условиях. Отмечает подъемы показателя тимоловой пробы в течение года. Результаты биопсии печени 3497-3500,3557-3560 Хронический гепатит вирусной этиологии с выраженной степенью активности с исходом в цирроз. ИГА-16 баллов.3 4. Страдает хроническим простатитом в течение нескольких лет.от 17.03.08. Нв 167 г/л, эритроциты 5,0 х 10 12 /л, ЦП 1,0, тромбоциты 140 х 109/л, лейкоциты 4,4109/л, ся 78 моноциты 1, лимфоциты 20,СОЭ 4 мм/ч, коагулограмма протромбиновый индекс 76, нафтоловый тест-отр, этаноловый-отр,фибриноген 3,33 г/л, липидный спектр холестерин общ 4,6 ммоль/л, альфа-холестерин 1,1 ммоль/л,триглицериды 1,5 ммоль/л, 3-липопротеиды 1,7 г/л,Р -холестерин 2,7 ммоль/л, коэф-нт атерогенности 3,1, ОАМ 200 мл , цвет св.желт, УВ 1013, реакция кислая, белок - абс, лейкоциты ед, эпителий плоский 0-1-2, пр. Зимницкого УВ 1018-1019, дневной 700 мл, ночной диурез 650 мл, пр.Реберга кол-во мочи 1380, мин.диурез 93 ммоль/л, креатинин крови 78 ммоль/л,креатинин мочи 8600 ммоль/л,клубочковая фильтрация 102,5,мл/мин, канальцевая реабсорбция 99,1, пр Нечипоренко лей-ты 250/мл,эр-ты - 0, цил-ры - 0. Биохимический анализ от 17.03.08 общий белок 75 г/л, креатинин 78 ммоль/л,глюкоза 4,5 ммоль/л, АЛТ 48 (до 46),33 (до 36), щелочная фосфатаза 350, амилаза 4,9. В динамикеот 26.03.08 - Нв 162 г/л,Эритроциты 5,2 х 10 12 /л, ЦП 0,93, тромбоциты 178109/л, лейкоциты 4,8109 /л, ся 56,эозинофилы 6, моноциты 5, лимфоциты 33,СОЭ 3 мм/ч, Биохимический анализ от 17.03.08. общий белок 75 г/л, креатинин 78 ммоль/л, глюкоза 4,5 ммоль/л, АЛТ 48 (до 46),33 (до 36),щелочная фосфатаза 350,амилаза 4,9 Биохимический анализ от 26.03.08 общий белок 74 г/л, креатинин 83 ммоль/л, глюкоза 4,3 ммоль/л,АЛТ 52 (до 46),36 (до 36), щелочная фосфатаза 440, амилаза 1,9 , тимоловая проба 10. ПЦР крови на РНК ВГС - результат позитивный Результаты исследования полиморфизма генов Гена ИЛ-10 кодона -1082 обнаружен генотип / Кодона -819 гена обнаружен генотип С/Т Кодона - 595 гена обнаружен генотип А/С Гена ангиотензиногена АТ-6 обнаружен генотип С/Т 25,кодона гена 1 обнаружен генотип / По полученным результатам можно прогнозировать у больного развитие компенсированного цирроза печени в исходе вирусного гепатита С класса(-). Пример 3. Больная Н., 1945 г.р. находилась на стац. лечении с 20.03.08 г. по 07.04.08.г. с диагнозом Основной Цирроз печени в исходе вирусного гепатита С. Декомпенсация. Синдром портальной гипертензии. Асцит. Анасарка. Гепатоспленомегалия. Печеночная энцефалопатия 1 степени. Хронический панкреатит. Обострение. Желчно-каменная болезнь. Хронический калькулезный холецистит, неполная ремиссия. Хронический гастрит,неполная ремиссия. Вторичный Т-клеточный иммунодефицит. Средней степени тяжести, декомпенсация. Жалобы на выраженную слабость, периодически боли в подложечной области, чувство тяжести в левом подреберье, снижение массы тела, иногда кожный зуд. Из анамнеза болеет с 2003 года, когда появилось снижение массы тела, слабость, обнаружена пупочная грыжа. Диагноз цирроз печени выставлен в декабре 2004 года. Неоднократно лечилась в стационарно. Последняя госпитализация в феврале 2008 года по месту жительства.от 21.03. 08. эр 3,61012, Нв 112 г/л, ЦПК 0,93, лейк. 2,9109,тромбоциты 75 тыс/мл, эоз. 2, с/я 44, лф 48 мон 6,СОЭ 10 мм/час. В динамике от 07.04.08. эр 3,910,Нв 119 г/л ЦПК 0, тромбоциты 99 тыс/мл, лейк. 2,8 х 109, эоз. 2, с/я 63, лф 31, мон 4, СОЭ 10 мм/час. Б/х крови от 21.03.08 общ. белок 74 г/л, сахар 4,2 ммоль/л, мочевина 7,7 ммоль/л, креатинин 99 ммоль/л, общ. билирубин 16 мкмоль/л, АЛТ 46 (до 46),45 (до 36), холестерин 4,1 ммоль/л, ахолестерин 1,0 ммоль/л, триглицериды 1,2 ммоль/л,4-липопротеиды 1,9 г/л,- холестерин 2,3 ммоль/л,коэффициент атерогенности 3,1. Коагулограмма ПТИ 70, нафтоловый тест отр.,этаноловый тест отр., фибриноген 2,44 г/л В динамике от 07.04.08 общ. белок 70 г/л, общ. билирубин 16 мкмоль/л, АЛТ 34(до 46),33 (до 36), амилаза 4,7 (3,3.-8,9) Коагулограмма в динамике от 02.04. 08. от 21.03.08 общ. белок 74 г/л, сахар 4,2 ммоль/л, мочевина 7,7 ммоль/л, креатинин 99 ммоль/л, общ. билирубин 16 мкмоль/л, АЛТ 46 (до 46),45 (до 36), холестерин 4,1 ммоль/л, холестерин 1,0 ммоль/л, триглицериды 1,2 ммоль/л,-липопротеиды 1,9 г/л, -холестерин 2,3 ммоль/л,коэффициент атерогенности 3,1. Коагулограмма ПТИ 70, нафтоловый тест отр., этаноловый тест отр., фибриноген 2,44 г/л. ОАМ от 21.03. 08 УВ 1020, белок отр., сахар нет, лейкоциты 5-10-12 в п/зр, эпит плоск, - единич. Проба Зимницкого Уд. вес мочи 1016-1019,Дневной диурез 650 мл, Ночной диурез 780 мл Результаты исследования крови на маркеры гепатита В- обнаружены антителаРезультаты исследования ПЦР на вирусные гепатиты положительные на РНК ВГС,отрицательные на ВГВ. Количественный анализ и генотип на ВГС - 42000 копий РНК/мл, генотип 3 а/. Иммунограмма от 21.03.08 г. Т-лимфоциты(18-25),незрелые Т-лимфоциты (48) 2,77(0), Тактивированные (3-) 10,33(5-10),- активированные В,-лимфоциты 24,21(10-23),(3/1656-) 8,15 (817),Т-киллеры 3/ 1656- 8,69(до 10). ЦИК 1,92 (1,130,02). Результаты исследования полиморфизма генов Гена ИЛ-10 кодона -1082 обнаружен генотип А/А Кодона -819 гена обнаружен генотип С/С Кодона - 595 гена обнаружен генотип С/С/ По полученным результатам можно прогнозировать у больного развитие декомпенсированного цирроза печени в исходе вирусного гепатита С класса В (-). Таким образом, заявляемый способ расширяет арсенал критериев для точного и информативного прогнозирования процесса в печени при хроническом гепатите С, позволяет выделить среди больных ХГС группу высокого риска развития цирроза печени и с большей уверенностью рекомендовать этим больным интенсивную противовирусную,а в перспективе и антифибротическую терапию. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ прогнозирования течения хронического вирусного гепатита С в казахской популяции, путем исследования крови больного, анализа комбинации полиморфизмов генов цитокинов, включающий получение образца геномной ДНК больного,тестирование указанной ДНК на наличие аллелей,оценку результатов и составление заключения о вероятности прогрессирующего течения заболевания, отличающийся тем, что исследуют кровь больных в казахской популяции, в которой определяют полиморфизм генов цитокинов 1 и ИЛ-10,дополнительно определяют ген ангиотензина АТ-6 и, при выявлении гомозиготного наследования генотипа 25 гена 1,гомозиготного наследования аллели С кодона-595 гена ИЛ-10 - прогнозируют прогрессирование хронической-инфекции в цирроз печени при выявлении гомозиготного генотипа/25 кодона гена 1, гомозиготного генотипа А/А кодона-1082, генотипа С/С кодона-819 гена ИЛ-10,гомозиготного генотипа С/С кодона-595 гена ИЛ-10,гомозиготного генотипа Т/Т гена ангиотензиногена АТ-6 прогнозируют развитие декомпенсированного цирроза печени при хроническом гепатите С.