Способ исследования мышечной ткани рыб на наличие паразитов

(51) 01 33/12 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ экспедиционно-полевых условиях, нетрудоемкого,надежного способа исследования тканей рыб на наличие метацеркариев, описторхов и других паразитов, могущего заменить компрессорий,обеспечить исследование как свежих, так и фиксированных образцов тканей, обезопасить от инфекций и частично дезинвазировать объекты,обеспечить сохранность материала в течение достаточно долгого времени. Способ исследования мышечной ткани рыб на наличие тканевых паразитов заключается в том, что образцы тканей толщиной 2-10 мм помещают в 3040 раствор карбамида на срок от 1-2 ч до 1-2 недель, после достижения мягкости и прозрачности компрессируют между предметными стеклами и просматривают под бинокулярной лупой для длительного хранения добавляют 15-20 хлорида натрия.(72) Дюсембаев Сергазы Турлыбекович Ермухамбетова Жазира Тарасовская Наталья Евгеньевна(56) Котельников Г.А. Гельминтологические исследования животных и окружающей среды. Справочник. М . Колос, 1983, с.203(54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ РЫБ НА НАЛИЧИЕ ПАРАЗИТОВ(57) Изобретение относится к области биологии,ветеринарии и ветеринарно-санитарной экспертизы,в частности, к способам исследования мышечной ткани рыб на наличие паразитов. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в разработке технически несложного, осуществимого в лабораторных и Изобретение относится к области биологии,ветеринарии и ветеринарно-санитарной экспертизы,в частности, к способам исследования мышечной ткани рыб на наличие паразитов. Известен способ исследования мышечной ткани рыб на наличие паразитов путем расщепления мышечных волокон тупым концом скальпеля таким способом можно найти инцистированные метацеркарии и молодых нематод филометроидесов Васильков Г.В. Гельминтозы рыб. - М. Колос,1983.-208 с. с. 33. Недостатком данного способа является возникновение угрозы повреждения личиночных форм и затруднение точного определения таксономического статуса или видовой принадлежности гельминта. Наиболее близким к изобретению является способ исследования мышечной ткани и тканей паренхиматозных органов на наличие паразитов заключающийся в раздавливании образца с помощью компрессорного стекла, взятый за прототип, который описан во многих источниках Котельников Г.А. Гельминтологические исследования животных и окружающей среды Справочник. - М. Колос, 1983. - 208 с., ил. с. 130 исследование мяса на трихинеллез, с. 174 исследование рыбы на описторхоз. Недостатком данного способа является необходимость использования специального, пусть и простого по устройству, прибора. Компрессорий доступен не всегда, к тому же отличается высокой стоимостью, требует навыков работы и может выйти из строя. Для компрессирования требуются тонкие кусочки ткани, а это значит, что при низкой интенсивности инвазии личинки могут не выявиться или же потребуется компрессия значительного числа образцов. Традиционное исследование на компрессорий требует очень мелких и тонких образцов исследуемого материала для мяса Котельников Г.А. (с. 130) рекомендует делать по 12 срезов величиной с овсяное зерно для рыбы (с. 174)- снимается поверхностный слой мышц толщиной 0,2-0,5 см, нарезается мелкими кусочками и размещается по поверхности компрессорного стекла. При низкой интенсивности инвазии(единичные личинки) паразиты могут не выявиться в малом количестве материала. Морфология личинок при компрессорном исследовании не всегда позволяет точно установить их видовую принадлежность или хотя бы таксономический статус часто требуется дополнительное просветление или исследование с перевариванием в искусственном желудочном соке (что требует дополнительных затрат труда, времени и реактивов). Кроме того, работа с нативным материалом может быть небезопасна для исследователя, так как ряд личиночных форм гельминтов рыб при недостаточном уровне гигиены может инвазировать человека пероральным путем, и к тому же велик риск передачи бактериальных инфекций. Фиксированные образцы тканей не годятся для компрессорного исследования, а работа непосредственно со свежим материалом не всегда возможна (в экспедиционнополевых условиях может не оказаться комперссория, времени и возможностей для ларвоскопии тканей. Хранение свежих образцов до исследования в лабораторных условиях не всегда возможно (для этого требуются холодильные установки или естественные источники холода). Некоторые патофизиологические изменения тканей могут сделать их ригидными,жесткими,непрозрачными, что затрудняет компрессирование и просмотр. Целью изобретения является разработка простого по исполнению, дешевого, доступного в любых условиях,надежного способа ларвоскопического исследования тканей рыб,могущего заменить приборы, обезопасить объекты от ряда инфекционных и инвазионных агентов и обеспечить сохранность материала в течение достаточно длительного времени. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в разработке технически несложного, осуществимого в лабораторных и экспедиционно-полевых условиях, нетрудоемкого,надежного способа исследования тканей рыб на наличие метацеркариев, описторхов и других паразитов, могущего заменить компрессорий,обеспечить исследование как свежих, так и фиксированных образцов тканей, обезопасить от инфекций и частично дезинвазировать объекты,обеспечить сохранность материала в течение достаточно долгого времени. Способ исследования объектов на наличие тканевых паразитов заключается в следующем. Образцы тканей толщиной 2-10 мм предварительно помещают в 30-40 раствор карбамида на срок от 12 ч до 1-2 недель. По мере того, как образцы станут мягкими,эластичными и полупрозрачными,раздавливают каждый кусочек ткани между двумя предметными стеклами (что не потребует значительных физических усилий) и просматривают визуально или под бинокулярной лупой при увеличении от 818 до 8756 раз. Тонкие, хорошо просветлившиеся кусочки можно просматривать визуально, без компрессии (особенно если паразиты достаточно крупные и хорошо видимые простым глазом). В растворе карбамида ткани могут храниться 1 -2 недели (в дальнейшем может быть чрезмерное размягчение и частичная мацерация). Для увеличения сроков сохранности образцов (без приобретения ими ригидности и потери прозрачности) до нескольких месяцев или лет добавляют в раствор карбамида 15-20 хлорида натрия или другой хорошо растворимой соли. Пример 1 - мышечную ткань рыбы разрезают на слои толщиной 2 мм и образцы помещают в 30-ый раствор карбамида и выдерживают в течение 1 часа. Затем раздавливают каждый кусочек ткани между двумя предметными стеклами и просматривают визуально или под бинокулярной лупой при увеличении от 8 18 до 8756 раз. Пример 2 - мышечную ткань рыбы разрезают на слои толщиной 10 мм и образцы помещают в 40 ый раствор карбамида и выдерживают в течение 2 часов. Затем раздавливают каждый кусочек ткани между двумя предметными стеклами и просматривают визуально или под бинокулярной лупой при увеличении от 818 до 8756 раз. Пример 3 - мышечную ткань рыбы разрезают на слои толщиной 5 мм и образцы помещают в 35 Пример ый раствор карбамида и выдерживают в течение 1,5 часа. Затем раздавливают каждый кусочек ткани между двумя предметными стеклами и просматривают визуально или под бинокулярной лупой при увеличении от 818 до 8756 раз. Результаты испытаний при различной концентрации карбамида и продолжительности выдержки показаны в нижеследующей таблице. Толщина слоя ткани 2 мм Время Состояние экспозиции ткани Хорошо просматривается насквозь визуально и легко раздавливается между 2 предметными стеклами. Хорошо просматривается визуально и раздавливается между 2 предметными стеклами без значительных физических усилий до тонкого слоя. Хорошо просматривается визуально и легко раздавливается между предметными стеклами до тонкого слоя. Как видно из таблицы, наиболее оптимальными являются условия примера 2, когда при толщине слой исследуемой мышечной ткани 5 мм достигается достаточный объем исследуемой ткани,снижается время экспозиции и сама концентрация раствора, образец быстро становится прозрачным и пригоден даже для визуального исследования. При этом увеличивается вероятность выявляемости личинок, особенно при низкой интенсивности инвазии. Механизмы действия предлагаемых веществ 1. Оптическая активность карбамида обеспечивает просветление всех растительных и животных тканей. Наличие асимметричного атома углерода в карбамиде (как и других органических соединениях с такими же свойствами) приводит к вращению плоскости поляризации света. 2. Воздействие карбамида на связи в белках заключаются в разрушении межмолекулярных комплексов (это свойство широко используется в биохимии и иммунологии для разрушения комплексов антиген-антитело) и частичном нарушении вторичной и третичной структуры белков, что приводит к размягчению мышечных тканей. 3. Слабощелочной (по сути, буферный) характер карбамида приводит к омылению жироподобных веществ (в том числе частичной деструкции фосфолипидных биологических мембран), щелочной денатурации и частичному гидролизу белков. 2-й и 3-й из названных факторов нарушают функции белков и других органических веществ - не только 3 самих тканей, но и микроорганизмов и паразитов,что обеспечивает дезинфекцию и отчасти - дезинвазию объекта, что делает нативный материал безопасным для здоровья исследователя. 4. Высокая концентрация карбамида (дающая высокое онкотическое давление раствора) в сочетании с высоким осмотическим давлением хлорида натрия обеспечивают сохранность объекта за счет уничтожения и угнетения жизнедеятельности микроорганизмов. 5. Карбамид связывает дурнопахнущие продукты разложения белков (сероводород, меркаптаны),обеспечивая дезодорацию материала и предотвращая появление неприятных запахов. Карбамид имеет основной, а сероводород и меркаптаны - кислотный характер, поэтому данные вещества легко химически связываются друг с другом в реакции нейтрализации. Преимущества предложенного способа исследования тканей 1. Достигается быстрое и сильное просветление ткани, позволяющее увидеть паразитов и другие включения визуально, а при тонких кусочках ткани обойтись без раздавливания (компрессии). 2. Размягчение ткани (без ее деформации и деформации паразитов) позволяет провести компрессию даже без специальных приборов и приспособлений между предметными стеклами, без значительных физических усилий. 3. Предложенный способ обеспечивает возможность исследования не только свежего, но и фиксированного материала - за счет того, что формальдегид с карбамидом образует метилмочевину, легко образующую линейные и разветвленные полимеры метиленмочевины. Метилмочевина и ее полимеры обладают оптической активностью, хорошо просветляют объект, делают его мягким, но при этом не разрушают и обеспечивают возможность длительного хранения без использования других консервантов. Фиксированный в формалине материал утрачивает запах, ригидность, в течение времени от 2-3 часов до суток (в зависимости от концентрации формалина и величины объекта) размягчается и становится прозрачным (за счет образования метилмочевины). При фиксации объекта в солевых растворах размягчение наступает достаточно быстро (за несколько часов). 4. В экспедиционно-полевых условиях появляется возможность достаточно длительного хранения, если нет возможности исследовать свежий материал сразу 1-2 недели объект может находиться в карбамиде без деструкции его тканей и паразитов, несколько месяцев или лет - с добавлением 15-20 хлорида натрия. 5. Карбамид обеспечивает дезодорацию материала - если он дурнопахнущий или уже подвергся порче и частичному разложению - с полным устранением всех неприятных запахов. 6. При выдерживании нативных тканей в карбамиде достигается дезинфекция и частичная дезинвазия материала(за счет высокого онкотического давления, токсичности карбамида для клеток,автоингибиции биохимических процессов и деструкции белковых комплексов). Обработанный таким образом материал безопаснее для здоровья исследователя, чем нативные образцы,используемые для исследования на компрессории. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ исследования мышечной ткани рыб на наличие паразитов, включающий подготовку проб и компрессирование, отличающийся тем, что образцы мышц разрезают на слои толщиной от 2-х до 10-ти мм, выдерживают в 30-40-ном растворе карбамида в течение 1-2-х часов, затем компрессуют между двумя предметными стеклами и просматривают визуально или под бинокулярной лупой. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для обеспечения длительного хранения образцов добавляют 15-20-ный раствор хлорида натрия. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что могут исследоваться как свежие, так и фиксированные образцы мышечной ткани.