Способ получения инактивированной культуральной вакцины против ящура из штамма picornavirus aphtae av-0027 (казниви) типа азия-1

(2010.01), 12 7/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ приготовление вируссодержащей суспензии, ее очистку, инактивацию вируса формалином и теплом, сорбцию вируса на геле гидрата окиси алюминия, добавление сапонина, в качестве вирусного штамма используют(КазНИВИ) типа Азия-1,репродуцированный в монослойной культуре перевиваемых клеток ВНК-21 24-48 ч культивирования,полученной высевом в концентрации 80020 тыс. кл/см 3,при множественности заражения 0,01 ТЦД 50/кл,выдерживают в контакте вируса с культурой клеток при температуре 37 С в течение 1 ч, затем содержимое сосудов выливают, вносят свежую порцию поддерживающей среды, культивируют при температуре 37,0-37,5 С в течение 48-72 ч до развития цитопатогенного действия в не менее чем 90-95 клеток, собирают биомассу культурального вируса однократным замораживанием при температуре минус 20 С в течение 24 ч и размораживанием при температуре 20-25 С,содержимое нескольких аналогичных сосудов объединяют смешиванием,затем в вируссодержащую суспензию добавляют 10 раствор формалина в конечной концентрации 0,03,инактивацию вируса формальдегида проводят в течение 24 ч при температуре 37-37,5 С в охлажденную суспензию добавляют 5 хлороформа,подвергают седиментации с последующей декальтацией,определяют остаточную вирулентность на мышатах-сосунках,добавляют гидроокись алюминий, сапонин и получают целевой продукт.(72) Абишов Абдикалык Абдижаппарович Мададов Малакша Фашанович Хайруллаева Куралай Амангельдиевна Калисынов Берик Серикбаевич Есходжаев Олжас Умирзахович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(56) ТУ 10-09-123-91 Универсальная моно-и поливалентная сорбированная вакцина против ящура типов А,О,С и Азия-1, 1991(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЯЩУРА ИЗ ШТАММА-0027 (КазНИВИ) ТИПА АЗИЯ-1(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано для специфической профилактики ящура среди парнокопытных домашних животных,вызываемой вирусом ящура типа Азия-1. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении высокоактивной вакцины, содержащей в единице объема готового продукта достаточно иммунизирующих доз. Способ получения инактивированной культуральной вакцины против ящура из штамма-0027 (КазНИВИ) типа Азия 1,включающий заражение новорожденных крольчат, репродукцию в них вируса ящура, 23108 Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано для специфической профилактики ящура среди парнокопытных домашних животных, вызываемой вирусом ящура типа Азия-1. Известен способ изготовления противоящурной вакцины из лапинизированного вируса типа Азия-1,включающий заражение новорожденных крольчат,репродукцию в них вируса ящура, приготовление вируссодержащей суспензии,ее очистку,инактивацию вируса формалином и теплом,сорбцию вируса на геле гидрата окиси алюминия,добавление сапонина ТУ 10-09-123-91 Универсальная монои поливалентная сорбированная вакцина против ящура типов А, О, С и Азия-1. - Утверждены ГУВ МСХ СССР,16.06.91 г. Недостатком известного способа получения вакцины против ящура типа Азия-1 является то, что вакцина не обладает достаточной биологической активностью и содержит в единице объема препарата малое количество иммунизирующих единиц. Задачей предлагаемого изобретения является повышения иммуногенности и биологической активности вакцины против ящура типа Азия-1. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении высокоактивной вакцины, содержащей в единице объема готового продукта достаточно иммунизирующих доз. Способ получения инактивированной культуральной вакцины против ящура из штамма-0027 (КазНИВИ) типа Азия 1,включающий заражение новорожденных крольчат, репродукцию в них вируса ящура,приготовление вируссодержащей суспензии, ее очистку, инактивацию вируса формалином и теплом, сорбцию вируса на геле гидрата окиси алюминия, добавление сапонина, в качестве вирусного штамма используют(КазНИВИ) типа Азия-1,репродуцированный в монослойной культуре перевиваемых клеток ВНК-21 24-48 ч культивирования,полученной высевом в концентрации 80020 тыс. кл/см 3,при множественности заражения 0,01 ТЦД 50/кл,выдерживают в контакте вируса с культурой клеток при температуре 37 С в течение 1 ч, затем содержимое сосудов выливают, вносят свежую порцию поддерживающей среды, культивируют при температуре 37,0-37,5 С в течение 48-72 ч до развития цитопатогенного действия в не менее чем 90-95 клеток, собирают биомассу культурального вируса однократным замораживанием при температуре минус 20 С в течение 24 ч и размораживанием при температуре 20-25 С,содержимое нескольких аналогичных сосудов объединяют смешиванием,затем в вируссодержащую суспензию добавляют 10 раствор формалина в конечной концентрации формальдегида 0,03,инактивацию вируса проводят в течение 24 ч при температуре 37-37,5 С 2 в охлажденную суспензию добавляют 5 хлороформа,подвергают седиментации с последующей декальтацией,определяют остаточную вирулентность на мышатах-сосунках,добавляют гидроокись алюминий, сапонин и получают целевой продукт. Способ осуществляется следующим образом. Для приготовления вакцины против ящура используют штамм-0027(КазНИВИ) типа Азия-1. Штамм депонирован и хранится в лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(КазНИВИ). Полученный штамм характеризуется следующими признаками. Назначение штамма штамм 0027 (КазНИВИ) вируса ящура типа Азия-1 патогенен по отношению к естественно восприимчивым животным и обладает высокой репродуктивностью в культуре клеток ВНК-21/13,которая способствует накоплению вирионов вируса в повышенных концентрациях в единице объема культуральной суспензии. Высокие концентрации вируса в культуральной суспензии обуславливают возможность получения из нее вакцинного препарата с высокими иммунобиологическими параметрами и повышенным содержанием иммунизирующих единиц в заданном объеме. Состав среды и условия культивирования для получения монослойной культуры клеток ВНК 21/13 используют ростовую среду содержащую 90 среды ИГЛА- и 10 сыворотки крови крупного рогатого скота, для культивирования вируса на этой культуре клеток из состава данной среды убирают сыворотки крови. Культивирования культуры клеток и вируса в ней осуществляют при температуре 37,0-37,5 С. Морфологические признаки. Штамм -0027(КазНИВИ) относится к семейству ,роду , виду , серотипу Азия-1 и обладает морфологическими признаками,характерными для возбудителя ящура форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров,расположенных в кубической симметрии. Культуральные свойства. Штамм -0027(КазНИВИ) вируса ящура типа Азия-1 репродуцируется и накапливается в культуре клетке ВНК-21/13 в титре 108,5 ТЦД 50/см 3 и выше (титр цитопатических доз, вызывающий клеточные поражения в монослое клеток у 50 инфицированной культуры, выращенной в сосудах). В указанных титрах штамм Азия-1 -0027(КазНИВИ) в культуре клеток накапливается после двукратного последовательного пассирования в указанной биологической модели и при использовании множественности заражения вирусом равной 0,01-0,05 ТЦД 50/кл. Цитопатогенное действие вируса в монослое зараженных клеток проявляется через 24 ч после инфицирования и(КазНИВИ) относится к серотипу Азия-1. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (Га - активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемых в РДП, РРИД,ИФА, РН. Иммунизация КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РДП, РРИД,ИФА, РН. Патогенные свойства. Штамм(КазНИВИ) вируса ящура типа Азия-1 патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок. Вирулентные свойства. Штамм(КазНИВИ) вируса ящура типа Азия-1 вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном,аэрозольном и парентеральном заражении. Иммуногенные свойства. Штамм -0027(КазНИВИ) вируса ящура типа Азия-1 иммуногенен в составе инактивированной вакцины. Реактогенное свойства. Штамм(КазНИВИ) вируса ящура типа Азия-1 реактогенными свойствами не обладает. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма -0027(КазНИВИ) вируса ящура типа Азия-1 при культивировании в культуре клеток ВНК-21/13 сохраняют в течение не менее 10 последовательных пассажей (срок наблюдения). Сохраняемость. Штамм -0027 (КазНИВИ) вируса ящура типа Азия-1 в культуральной суспензии сохраняет свою исходную биологическую активность при температуре 41 С в течение 30 суток (срок наблюдения), при минус 20 С - 6 месяцев (срок наблюдения), а при минус 40 С - 12 месяцев (срок наблюдения). Лиофилизированный в смеси со стабилизирующей средой, содержащей пептон 4, сахарозу 3 и желатина 1, сохраняет биологическую активность при температуре 41 С в течение не менее 18 месяцев. Пример 1. Для получения инактивированной культуральной вакцины против ящура готовят монослойную культуру клеток ВНК-21 путем высева 1,5-литровые матрасы в концентрации 600800 тыс. кл/см 3,которые культивируют стационарным способом в среде ИГЛА-,содержащей 10 сыворотка крови крупного рогатого скота при температуре 37,0-37,5 С в течение 24-48 ч. до образования плотного монослоя. Для заражения вирусом ящура отбирают матрасы с плотным клеточным монослоем, сливают ростовую питательную среду, 2-3 раза промывают раствором Хенкса, чтобы удалить неспецифические ингибиторы. Затем вносят вирус ящура типа Азия-1-0027 (КазНИВИ) в дозе 0,010,1 ТЦД 50/кл и оставляют на один час при температуре 37 С для адсорбции вируса на поверхность клеток. Затем вируссодержащий материал удаляют из матрасов, вносят в них поддерживающую питательную среду ИГЛА-. Зараженные культуры клеток инкубируют в термостате при температуре 37-37,5 С в течение 2024 ч, до развития цитопатогенного действия вируса на не менее чем 85-90 площади монослоя клеток. В период максимального развития цитопатогенного действия вируса культуру клеток в сосудах подвергают двукратному замораживанию при температуре минус 20 С в течение 24 ч и размораживают при комнатной температуре. Содержимое нескольких аналогических сосудов объединяют и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и биологическую активность. Стерильность устанавливают путем высева на бактериальные среды МПА, МПБ, Чапека, Сабуро и Китт-Тароцци,а биологическую активность титрованием в монослойной культуре перевиваемых клеток ВНК-21, выращенных в пробирках. При отсутствии посторонних контаминантов микробиологического, микологического характера и наличии титра вируса в суспензии не ниже 1075 ТЦД 50/см 3 в культуральную суспензию добавляют 10 раствор формалина. Конечная концентрация формальдегида в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025-0,03. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 24 ч при 37 С и рН 7,2-7,4 с перемешиванием через 2-3 ч в течение 2-3 мин. По окончании инактивации суспензию антигена охлаждают до 4-8 С. В охлажденную суспензию добавляют хлороформ до концентрации 5 для флоккуляции балластных примесей. Флоккулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией. Полученный антиген контролируют на авирулентность и стерильность. Необходимую концентрацию 146 75 компонентов в прививной дозе адсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена гелем гидрата окиси алюминия (ГОА). Расчетный объем геля ГОА 3 концентрации добавляют в охлажденную суспензию антигена при постоянном перемешивании в течение 30 мин. После седиментации геля ГОА сливают расчетный объем надосадочной жидкости или измеряют объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,60,450 мг/мл, а концентрация 146 75 компонентов вируса ящура, не менее 2 мкг/мл. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10 раствор сапонина до конечной концентрации, не менее 0,075. Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные флаконы. Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым белым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании, которая после стандартизационных испытаний на иммунобиологические показатели используется в качестве вакцинного препарата. 3 23108 Иммунобиологические свойства инактивированной культуральной вакцины характеризуется следующими данными. Стерильность по отношению к посторонним контаминантам. Стерильность вакцины испытывают согласно требованиям ГОСТ 28085-89. В вакцине не должны присутствовать посторонние контаминанты бактериального, грибкового и вирусного характера. Безвредность и токсичность. На безвредность и токсичность вакцины проверяют подкожным введением ее двум взрослым кроликам в дозе 2 мл,пяти морским свинкам в дозе 1 мл, и пяти взрослым белым мышам в дозе 0,2 мл. Срок наблюдения за животными 10 суток. Вакцина должна быть безвредной и не токсичной для лабораторных животных. Авирулентность. На авирулентность вакцины проверяют подкожным введением ее 20 мышамсосунам в дозе 0,2 мл. Мышат содержат совместно с лактирующими матками. Наблюдение ведут в течение 5 суток. Вакцину считают авирулентной, если все привитые животные в течение 5 суток останутся клинически здоровыми. Иммуногенность. Иммуногенность вакцины испытывают на морских свинках живой массой 400450 г. Для этого ее вводят внутримышечно 8 лабораторным животным в дозе 1,0 мл. Через 21 суток всех привитых и 8 контрольных морских свинок заражают адаптированных к этим животным гомологичным вирусом ящура интрадермально в плантарную поверхность одной из задних конечностей в дозе 104 ИД 50 в объеме 0,1 мл. Вакцина считается иммуногенной, если в течение 7 суток у вакцинированных животных не наблюдают генерализации ящурного процесса передних и одной задней конечностях. Генерализацией считают образование вторичных афт хотя бы на одной конечности, в которую вирус ящура не вводили. Контроль вакцины считают действительным, если из контрольных морских свинок генерализованной формой ящура заболевают не менее 7 животных. Применение способа получения инактивированной культуральной вакцины против ящура из штамма-0027(КазНИВИ) типа Азия-1 позволит серийно изготавливать вакцину против ящура животных и внедрить этот препарат в ветеринарную практику для специфической профилактики заболевания среди крупного и мелкого рогатого скота. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения инактивированной культуральной вакцины против ящура включающий заражение новорожденных крольчат, репродукцию в них вируса ящура, приготовление вируссодержащей суспензии, ее очистку, инактивацию вируса формалином и теплом, сорбцию вируса на геле гидрата окиси алюминия, добавление сапонина,отличающийся тем, что в качестве вирусного штамма используют-0027(КазНИВИ) типа Азия-1, репродуцированный в монослойной культуре перевиваемых клеток ВНК-21 24-48 ч культивирования, полученной высевом в концентрации 80020 тыс.кл/см 3, при множественности заражения 0,01 ТЦД 50/кл,выдерживают в контакте вируса с культурой клеток при температуре 37 С в течение 1 ч, затем содержимое сосудов выливают, вносят свежую порцию поддерживающей среды, культивируют при температуре 37,0-37,5 С в течение 48-72 ч до развития цитопатогенного действия, собирают биомассу культурального вируса однократным замораживанием при температуре минус 20 С в течение 24 ч и размораживают при температуре 2025 С, содержимое нескольких аналогичных сосудов объединяют смешиванием,затем в вирусосодержащую суспензию добавляют 10 раствор формалина в конечной концентрации формальдегида 0,03,инактивацию вируса проводят в течение 24 ч при температуре 37-37,5 С в охлажденную суспензию добавляют 5 хлороформа, подвергают седиментации с последующей декальтацией, определяют остаточную вирулентность.