Способ получения антигена для серологической диагностики трихофитии верблюдов

(51) 61 39/10 (2006.01) 61 10/00 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ ресуспендирование в физиологическом растворе,фильтрацию взвеси, инактивацию, добавление 0,5 формалина и выдерживание при температуре 37 С в течение 2 дней, в качестве грибковой культуры используют штамм гриба 0319, который выращивают на твердой питательной среде с последующим смывом биологической массы, отмыванием и суспендированием в физиологическом растворе, полученную суспензию,инактивируют ультразвуком дезинтеграторе УЗДНА двукратно при частоте 22 кГц и мощности 100 Вт/см 2 с интервалом 30 мин, затем добавляют 50 трихлоруксусную кислоту, разведенную в 19 частях гомогената, затем полученную смесь тщательно перемешивают и оставляют на 10-15 ч при температуре 4 С,после чего гомогенат центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин,надосадочную жидкость удаляют,осадок ресуспендируют дистиллированной водой трехкратно путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 30 мин, надосадочную жидкость вновь отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 0,5 фенолизированном физиологическом растворе,тщательно перемешивают и помещают в холодильник на 24 ч, затем встряхивают, фильтруют через четырехслойную марлю и доводят рН до 7,07,2,после чего антиген растворяют в физиологическом растворе с рН 8,5 и доводят до концентрации белка 1 мг/см 3. 2 табл.(72) Умитжанов Мынбай Токеев Шукирбай Орынбаевич Бижанов Болат Рахметович Боранбаева Райхан Султанмуратовна Шалабаев Болат Абуович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(56) Дроздов А.И. Методы выделения антигенов из патогенных грибов. Методическое пособие. Л. ГИДУВ, 1971, с. 31(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТРИХОФИТИИ ВЕРБЛЮДОВ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микологии и может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической диагностики дерматомикоза верблюдов. Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в получении высокоактивного и стабильного антигена из штамма-0319 для постановки серологической реакции при диагностике трихофитии верблюдов. Способ получения антигена для серологической диагностики трихофитии верблюдов, включающий выращивание культуры грибов на питательной среде с последующим снятием биологической массы, смывание, отмывание, суспендирование, 23107 Изобретение относится к области ветеринарной микологии и может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической диагностики дерматомикоза верблюдов. Известен способ получения антигена для серологической диагностики трихофитии верблюдов, включающий выращивание культуры грибов на питательной среде с последующим снятием биологической массы,смывание,отмывание, суспендирование, ресуспендирование в физиологическом растворе, фильтрацию взвеси,инактивацию, добавление 0,5 формалина и выдерживание при температуре 37 С в течение 2 дней Дроздов А.И. Методы выделения антигенов из патогенных грибов. Методическое пособие.- Л. ГИДУВ, 1971.-с.31. Недостатком данного метода является то, что полученный антиген не позволяет выявлять латентные формы инфекции и не обладают достаточной активностью и специфичностью. Задачей изобретения является получение высокоактивного и стабильного антигена для постановки серологической реакции с сыворотками крови и повышение его чувствительности. Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в получении высокоактивного стабильного антигена из вакцинного штамма для постановки серологической реакции при диагностике трихофитии верблюдов. Способ получения антигена для серологической диагностики трихофитии верблюдов, включающий выращивание культуры грибов на питательной среде с последующим снятием биологической массы, смывание, отмывание, суспендирование,ресуспендирование в физиологическом растворе,фильтрацию взвеси, инактивацию, добавление 0,5 формалина и выдерживание при температуре 37 С в течение 2 дней, в качестве грибковой культуры используют штамм гриба 0319, который выращивают на твердой питательной среде с последующим смывом биологической массы, отмыванием и суспендированием в физиологическом растворе, полученную суспензию,инактивируют ультразвуком дезинтеграторе УЗДНА двукратно при частоте 22 кГц и мощности 100 Вт/см 2 с интервалом 30 мин, затем добавляют 50 трихлоруксусную кислоту, разведенную в 19 частях гомогената, затем полученную смесь тщательно перемешивают и оставляют на 10-15 ч при температуре 4 С, после чего гомогенат центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин,надосадочную жидкость удаляют,осадок ресуспендируют дистиллированной водой трехкратно путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 30 мин, надосадочную жидкость вновь отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 0,5 фенолизированном физиологическом растворе,тщательно перемешивают и помещают в холодильник на 24 ч, затем встряхивают, фильтруют через четырехслойную марлю и доводят рН до 7,07,2,после чего антиген растворяют в физиологическом растворе с рН 8,5 и доводят до концентрации белка 1 мг/см 3. 2 Способ получения антигена состоит в следующем. Пример 1. Культуру штамма гриба-0319 выращивают на твердой питательной среде в течение 21 суток с последующим их снятием с поверхности агара и добавляют физиологический раствор рН 7,0-7,2,измельчают в гомогенизаторе, фильтрует через четырехслойной марлевый фильтр,затем инактивирует ультразвуком двукратно при частоте 22 кГц и мощности 100 Вт/см 2 с интервалом 30 мин,затем добавляют 50 трихлоруксусную кислоту,разведенную в 19 частях гомогената, затем полученную смесь тщательно перемешивают и оставляют на 10-15 ч при температуре 4 С, затем после чего гомогенат центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют дистиллированной водой трехкратно путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 30 мин, надосадочную жидкость вновь отбрасывают,а осадок ресуспендируют в 0,5 фенолизированном физиологическом растворе,тщательно перемешивают и помещают в холодильник на 24 ч,затем встряхивают,фильтруют через четырехслойную марлю и доводят рН до 7,0-7,2,после чего антиген растворяют в физиологическом растворе с рН 8,5 и доводят до концентрации белка 1 мг/см 3. Пример 2. Серологическую реакцию агглютинации с антигеном проводят в чистых сухих стеклянных пробирках Флоринского. На наружной стенке пробирки указывают номер испытуемой пробы сывороток крови. Реакцию ставят на 2-ном растворев разведениях сывороток крови верблюдов 125, 150,1100, 1200, 1 400 в количестве 0,5 см 3 каждого. При каждой постановке реакции одновременно с испытуемыми пробами ставят контроли с негативной и позитивной трихофитиной сывороткой в тех же разведениях, как испытуемые. После этого в каждую пробирку вносят по 0,5 см 3 антигена, предварительно разбавленного в соотношении 15 соответствующей концентрацией раствором хлорида натрия. Смесь исследуемых проб сывороток крови и антигена тщательно перемешивают до получения однородной массы. После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена, штативы с пробирками помещают в термостат при температуре 37-38 С на 4 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего проводят учет реакции. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в крестах по следующей схеме(4 креста) - полное просветление жидкости,агглютинат оседает на дно пробирки в виде зонтика(3 креста) - полное просветление жидкости,и хорошо выраженный зонтик(2 креста) - не просветление жидкости, зонтик умеренно выражен(1 крест)едва заметно просветление жидкости, зонтик выражен очень слабо- (минус) - осадок отсутствует, жидкость равномерно сине-фиолетового цвета. За диагностический титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем в 2 креста, что соответствует количеству международных единиц антител в 1,0 см 3 сыворотки. Контролем служат заведомо отрицательная и положительная трихофитиные пробы сывороток крови животных. Специфичность предложенного антигена,отражена в таблице 1. Из таблицы 1 видно, что при сравнительном испытании специфичности предложенного антигена в реакции агглютинации (РА) и в реакции длительного связывания комплементов (РДСК) с биофабричным трихофитиным антигеном, при исследовании лимфангитных сывороток крови, во всех случаях были отрицательные результаты,кроме трихофитиным, что свидетельствуют о специфичности приготовленного диагностикума. Специфичность и чувствительность пробирочной реакции агглютинации с разработанным антигеном в РДСК с биофабричным трихофитиным антигеном изучали также путем исследования 157 сывороток крови больных трихофитией верблюдов из различных районов Алматинской области. Результаты серологических реакций при исследовании сывороток крови больных трихофитией верблюдов, показаны в таблице 2. Как видно из таблицы 2, в благополучных по трихофитии верблюдоводческих хозяйствах, все животные имели отрицательные показания как в РДСК с биофабричным трихофитиным антигеном,так и в реакции агглютинации (РА) с разработанным антигеном, а при исследовании на трихофитии верблюдов 35 проб сывороток крови верблюдов из неблагополучных хозяйств получены следующие результаты в РДСК позитивные показания были в 15 случаях и 1 проба давала сомнительный результат. В РА положительные результаты с разработанным антигеном получены в 16 случаях,при этом 1 животное реагировавшие сомнительно в РДСК, реагировало положительно в РА. Одним из основных преимуществ РА с разработанным антигеном позволяют получить диагноз за короткие сроки на трихофитию верблюдов уже через 4 ч после постановки реакции. Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что РА с разработанным диагностикумом превосходит по результативности РДСК с биофабричным трихофитиным антигеном при исследовании сывороток крови верблюдов, а также значительно сокращает время постановки реакции, позволяет получить диагноз в короткие сроки, что способствует предотвращению скрытой стадии распространения заболевании путем своевременной изоляции больных трихофитией верблюдов. Таблица 1 Специфичность предложенного антигена Исследуемые сыворотки Результаты серологической реакции РА с испытуемым РДСК с биофабричным трихофитиным антигеном трихофитиным антигеном 125 150 15 110 Таблица 2 Результаты серологической реакций, при исследовании сывороток крови верблюдов на трихофитию Кол-во Исследованных голов Сыворотки крови РДСК с биофабричным РА с предложенным трихофитиным антигеном антигеном Положи- СомниОтри ПолоСомни Отрицатель жительцательтельный тельный ный тельный ный ный 57 57 15 1 19 16 19 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена для серологической диагностики трихофитии верблюдов, включающий выращивание культуры грибов на питательной среде с последующим снятием биологической массы, смывание, отмывание, суспендирование,ресуспендирование в физиологическом растворе,фильтрацию взвеси, инактивацию, добавление 0,5 формалина и выдерживание при температуре 37 С в 3 23107 течение 2 дней, отличающийся тем, что в качестве грибковой культуры используют штамм гриба-0319, который выращивают на твердой питательной среде с последующим смывом биологической массы, отмывание и суспендирование в физиологическом растворе,полученную суспензию,инактивируют ультразвуком в дезинтеграторе УЗДН-А двухкратно при частоте 22 кГц и мощности 100 Вт/см 2 с интервалом 30 мин, затем добавляют 50 трихлоруксусную кислоту, разведенную в 19 частях гомогената, затем полученную смесь тщательно перемешивают и оставляют на 10-15 ч при температуре 4 С,после чего гомогенат центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин,надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют дистиллированной водой трехкратно путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 30 мин, надосадочную жидкость вновь отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 0,5 фенолизированном физиологическом растворе,тщательно перемешивают и помещают в холодильник на 24 ч, затем встряхивают, фильтруют через четырехслойную марлю и доводят рН до 7,07,2,после чего антиген растворяют в физиологическом растворе с рН 8,5 и доводят до концентрации белка 1 мг/см 3.