Штамм бактерий lactobacillus salivarius 8д/ак-5, предназначенный для включения в состав микробных препаратов против бруцеллеза

(51) 12 1/20 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ штамм молочнокислых бактерий, который может быть использован в составе микробных препаратов против бруцеллеза. Задача изобретения - получение нового штамма молочнокислых бактерии,обладающего устойчивостью к желчи и низкому значению , а также высокой антагонистической активностью по отношению к возбудителям бруцеллеза. Технический эффект. Получен новый штамм молочнокислых бактерий 8 д/Ак-5, включение которого в состав микробных препаратов позволит повысить их эффективность за счет сохранения жизнеспособности при прохождении через желудочно-кишечный тракт и высокой антагонистической активности к возбудителям бруцеллеза.(76) Саданов Аманкелди Курбанович Гаврилова Нина Николаевна Ратникова Ирина Александровна Бектурганов Нуралы Султанович(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ 8 Д/АК-5, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ВКЛЮЧЕНИЯ В СОСТАВ МИКРОБНЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА Изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет собой новый штамм молочнокислых бактерий, который может быть использован в составе микробных препаратов против бруцеллеза. На сегодняшний день бруцеллез - очень большая угроза для жизни и здоровья людей, усугубленная трудностями его полной ликвидации. Наибольшую распространенность это заболевание получило среди контингента населения, занимающегося животноводством. Одним из способов профилактики и лечения бруцеллеза может быть использование для этих целей пробиотиков-антагонистов бруцелл. Известен штамм молочнокислых бактерий 8 д ИМИВ В-12 - ингибитор роста бруцелл(11)5765, бюл. 1, 15.01.98). Проверка антагонистической активности этого штамма лактобактерий в отношении бруцеллна белых мышах показала его высокую лечебную эффективность, не уступающую антибиотику гентамицину Доказана также эффективность штамма при комплексном лечении бруцеллеза совместно с Ко-тримаксазолом.59. , 2006.-.34). Недостатком штамма является недостаточная устойчивость к желчи и низкому значению , что может быть причиной снижения его эффективности при применении. Задача изобретения - получение нового штамма молочнокислых бактерий,обладающего устойчивостью к желчи и низкому значению , а также высокой антагонистической активностью по отношению к возбудителям бруцеллеза. Поставленная задача достигается получением нового штамма молочнокислых бактерий 8 д/Ак-5, устойчивого к желчи и рН 3, обладающего высокой антагонистической активностью к возбудителям бруцеллеза. Штамм .8 д/Ак-5 выделен из популяции штамма .8 д в процессе его адаптации к желчи и низкому значению . Двухсуточная культура .8 д/Ак-5 представляет собой грамположительные аспорогенные палочки с закругленными концами диаметром 0,7-1,00,8-1,2 мкм, одиночные, парные или в изогнутых цепочках. Тип размножения бинарное деление. При росте на твердой питательной среде образует круглые гладкие колонии с ровным краем,не пигментированные, размером 1-3 мм. При росте в жидкой питательной средепри 37 С в течение 18-24 ч происходит помутнение среды с прозрачным кольцом в верхнем слое. Факультативный анаэроб. Оптимальная температура роста 37 С. В качестве источника углерода использует арабинозу, рибозу, целлобиозу, галактозу, глюкозу,глюконат, раффинозу, мальтозу, мелибиозу,сахарозу, лактозу, сорбит, дульцит, маннит,маннозу. Использует органические источники азота пептон, дрожжевой автолизат или экстракт, мясной экстракт, кукурузный экстракт, экстракт солодовых ростков. Воздействия на желатин не оказывает. 2 и индол не образует. Не обладает каталазной активностью. Активно развиваются в бульоне с 4,5 . Устойчив к желчи и низкому значению,проявляет высокую антагонистическую активность в отношении возбудителей бруцеллеза. Не патогенен. Штамм депонирован в коллекции Института микробиологии и вирусологии МОиН РК. Коллекционный номер ИМиВ В-28. Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами. Пример 1. Культуры .8 д и .8 д/Ак-5 выращивают отдельно в течение 24 ч при 37 С в питательной среде(г/л) дрожжевой экстракт 5.0 мясной экстракт - 10,0 пептон - 10,0 глюкоза 20,0 лимоннокислый аммоний - 2,0 уксуснокислый натрий - 5,0 твин 80 - 1,0 24 - 2,0 КН 2 РО 4 2,0 472 - 0,2 442 - 0,05 ( 6,2-6,6). Затем из них отбирают по 1 мл, вносят в 10 мл стерильного физиологического раствора с 3,0 и выдерживают в термостате при 37 С в течение 30 и 60 мин. После этого пробы нейтрализуют и определяют в них количество выживших бактерий путем высева из соответствующих разведений в чашки Петри на агаризованную питательную среду. Подсчет количества выросших колоний производят на 3 сутки после термостатирования чашек при температуре 37 С. Результаты представлены в таблице 1. Таблица 1 Выживаемость молочнокислых бактерий при 3 Содержание жизнеспособных клеток, КОЕ/мл исходное 40 мин при 3 60 мин при рН 3 1,2108 5,2106 2,0106 9 9 10,010 9,010 7,9109 Как видно из представленной таблицы, после экспозиции в среде с 3 в течение 30 и 60 минут в культуре .8 д происходит снижение числа жизнеспособных клеток на 2 порядка. В этих же 2 условиях титр бактериальных клеток в культуре примере 1, с добавкой 3 желчи в течение 24 часов при температуре 37 С. Затем определяют количество жизнеспособных бактерий путем высева из соответствующих разведений в чашки Петри на агаризованную среду . Подсчет количества выросших колоний производят на 3 сутки после термостатирования чашек при температуре 37 С. Результаты исследований, представленные в таблице 2, свидетельствую о том, что предлагаемый штамм молочнокислых бактерий намного превосходит противопоставляемый по устойчивости к желчи. Так, если снижение титра бактериальных клеток при росте культуры .8 д в питательной среде с 3 желчи произошло на 5 порядков по сравнению с исходной питательной средой, то у культуры .14 д/А-7 при тех же условиях титр бактерий был ниже на 1 порядок. Таблица 2 Рост молочнокислых бактерий в питательной средес 3 желчи Штаммы Содержание жизнеспособных клеток, КОЕ/мл исходная питательная среда с добавкой 3 желчи 2,0108 1,5103 9 8,910 7,8108 Пример 3. Культуры .8 д и .8 д/Ак-5 выращивают в питательной среде , описанной в примере 1, в течение 24 часов при температуре 37 С. Затем определяют в них антагонистическую активность в отношении различных видов бруцелл 16,544,1330 и штамм 520 в сравнении с антибиотиками доксициклином и римфациклином. Антагонистическую активность в отношении взятых в опыт тест-культур устанавливают следующим образом. Чашки Петри с ровным дном помещают на горизонтальную поверхность. На водяной бане расплавляют в колбах стерильную плотную питательную среду следующего состава (г/л) бульон Хоттингера - 30,0 пептон - 5,0 натрий хлористый - 5,0 глюкоза -10,0 агар-агар - 20,0 вода питьевая для доведения объема среды до 1 дм 3. После охлаждения до 45-50 С в агаризованную среду вносят взвесь тест-культуры из расчета 1,0 см 3 одномиллиардной взвеси на 100 см 3 среды. Содержимое колбы перемешивают и разливают в чашки Петри по 10 см 3 в каждую. В застывшей среде бором вырезают лунки, обычно по шесть. В приготовленные лунки вносят по 0,1 см 3 односуточной культуры молочнокислых бактерий. Затем чашки выдерживают около 3 ч при комнатной температуре для диффузии раствора в агар, после чего помещают в термостат при температуре 37 С на 16-18 ч. Измеряют диаметр зон подавления роста тест-культур. Для каждого образца рассчитывают среднее арифметическое значение не менее чем из трех определений. Результаты исследований представлены в таблице 3. Таблица 3 Антагонистическая активность различных штаммов . Варианты.8 д/Ак-5 40 25 19 доксициклин 40 40 40 римфациклин 28 30 33 Установлено, что наибольшую активность при росте на средепроявили оба штамма в отношении В.16 и шт.520 (зоны подавления роста тест-культур были больше 40 мм). Такую же активность к данным тест-культурам проявил антибиотик доксициклин. Римфациклин имел зону подавления роста теста 520 также больше 40 мм, но уступал молочнокислым бактериям и доксициклину по антимикробному действию в отношении В.16 (28 мм). Активность молочнокислых бактерий в отношении остальных тест-культур была меньше по сравнению с антибиотиками, однако достаточно высокой. Так,штаммы ,8 д и .8 д/Ак-5 имели зоны подавления роста В.544, равные 23 и 25 мм, соответственно, а В.1330 по 19 мм. Таким образом,предлагаемый штамм молочнокислых бактерий .8 д/Ак-5 превосходит противопоставляемый штамм.8 д по устойчивости к желчи и к 3,что свидетельствует о лучшей его выживаемости при прохождении через желудочно-кишечный тракт. Кроме того, штамм обладает наравне с противопоставляемым штаммом высокой антагонистической активностью в отношении различных возбудителей бруцеллеза, а в отношении В.544 - превосходит его. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерий 8 д/Ак-5,депонированный в коллекции Института микробиологии и вирусологии МОН РК под коллекционным номером ИМиВ В-28,предназначенный для включения в состав микробных препаратов против бруцеллеза.